王文彬，　孔德昭，　唐麗娟，　馬　偉，匡　華（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

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雙抗體夾心酶聯(lián)免疫方法檢測丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌

王文彬，孔德昭，唐麗娟，馬偉，匡華*
（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

摘要：丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌可以引起十字花科細(xì)菌性黑斑病，是侵染蘿卜、白菜、花椰菜等農(nóng)作物的重要病害之一。以滅活的丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌（NCPPB1820）為免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，篩選最終獲得6株產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）與抗體偶聯(lián)，作為檢測探針，分別將6種單克隆抗體作為包被抗體，進(jìn)行兩兩配對(duì)篩選。結(jié)果表明，所制備的抗體特異性較好，對(duì)水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、玉米細(xì)菌性枯萎病菌、丁香假單胞菌丁香致病變種均沒有交叉反應(yīng)。以6號(hào)抗體作為檢測抗體（6-HRP），以1號(hào)抗體作為包被抗體，建立酶聯(lián)免疫分析法獲得了最佳的敏感度。檢測丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種的最低檢測限為1.5×105cfu/mL，定量限為4.12×105cfu/mL?；陔p抗體夾心的酶免疫方法特異性好，便捷，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌高通量測定。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫測定；單克隆抗體；丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌

由丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種（Pseudomonas syringae pv. Maculicola）病菌引起的十字花科細(xì)菌性黑斑病是世界上重要的十字花科蔬菜細(xì)菌性病害[1]。該病菌在分類上屬于原核生物細(xì)菌界、變形桿菌門、假單胞菌科[2]。該菌最適培養(yǎng)溫度在25～27℃，主要宿主有白菜、蘿卜、花椰菜等十字花科蔬菜。2002年湖北省長陽縣一處蔬菜基地的蘿卜爆發(fā)的蘿卜細(xì)菌性黑斑病即是由該病菌引起的[3]。

國外關(guān)于該病菌的研究主要集中在致病機(jī)理的研究以及用脈沖電場凝膠電泳對(duì)該丁香假單胞菌進(jìn)行分型[4-7]。目前，對(duì)于病原微生物的測定技術(shù)主要有免疫檢測和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。Youfu Zhao等建立了檢測丁香假單胞菌冠菌素的間接競爭ELISA方法[8]。國內(nèi)對(duì)丁香假單胞桿菌的研究較少。黃瓊等對(duì)丁香假單胞菌中6個(gè)致病變種的全細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行了電泳和分析，發(fā)現(xiàn)該方法可以鑒定不同的丁香假單胞菌致病變種[9]。王華杰對(duì)丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種進(jìn)行了詳細(xì)的研究和綜述[2]。然而，免疫技術(shù)檢測丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌尚無報(bào)道[10]。因此，作者以危害十字花科植物的重要病原微生物丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌為對(duì)象，開發(fā)并建立雙抗體夾心法酶免疫測定方法，為實(shí)現(xiàn)丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌的快速鑒定和高通量、快速分析提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種（Pseudomonas syringae pv. Maculicola，NCPPB1820），水稻細(xì)菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae，NCPPB 3591），水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola，NCPPB 1585），玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp.stewartii，NCPPB449），丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae，NCPPB2844）：來自英國NCPPB中心。哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液BHI干粉：北京陸橋技術(shù)有限公司。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，明膠：購于Sigma公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：阿拉丁試劑公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG：康成生物工程公司產(chǎn)品；沉淀型單組份TMB底物溶液：上海天根公司；Tween-20，氯化鈉，磷酸二氫鉀，十二水磷酸氫二鈉，檸檬酸和濃硫酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器

MK3酶標(biāo)儀：美國Thermo scientific公司；PH050A型培養(yǎng)箱：上海恒一科學(xué)儀器有限公司制造；96孔酶標(biāo)板，美國Corning公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)方法丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種凍存菌株在哥倫比亞平板上，27℃培養(yǎng)2～3 d。之后單菌落接種在BHI液體培養(yǎng)基中，27℃培養(yǎng)2 d。

1.3.2單克隆抗體的制備滅活的丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種標(biāo)準(zhǔn)菌株與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化至形成油包水結(jié)構(gòu)后皮下多點(diǎn)注射免疫6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，劑量為108cfu/只，間隔周期為3周，第3次免疫時(shí)劑量減半。第3次免疫1周后對(duì)小鼠尾部采血，利用間接酶聯(lián)免疫法檢測血清效價(jià)，待效價(jià)達(dá)到要求（血清滴度＞1∶10，000）后挑選效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖刺免疫。沖刺免疫采用腹腔注射，沖刺劑量為2×107cfu/只。沖刺免疫3 d后，將小鼠處死并取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。采用間接酶聯(lián)免疫法對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行分析，挑選分泌特異性識(shí)別丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種菌株的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。采用體內(nèi)誘生法制備小鼠腹水，采用辛酸飽和硫酸銨法純化腹水，獲得單克隆抗體。單克隆抗體標(biāo)記HRP采用NaIO4法，詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)[11]。

1.3.3抗體配對(duì)篩選利用雙抗體夾心法進(jìn)行單克隆抗體的配對(duì)篩選，操作方法如下：將制備的單克隆抗體分別用包被溶液（pH 9.6，碳酸鹽緩沖液）稀釋至5 μg/mL，包被酶標(biāo)板，然后進(jìn)行封閉，封閉后加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置陽性對(duì)照（P，5×107cfu/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌株溶液，100 μL/孔）和陰性對(duì)照（N，磷酸鹽緩沖液PBS，100 μL/孔），37℃反應(yīng)1 h后，加入HRP標(biāo)記的抗體（用抗體緩沖液稀釋1 000倍）并在37℃反應(yīng)1 h，顯色，終止反應(yīng)。檢測后，陽性孔吸光值與陰性孔吸光值比值（P/N）≥2.1的配對(duì)認(rèn)為是成功的。比較各組的P/N值，選擇比值最高的兩株抗體進(jìn)行下續(xù)方法的優(yōu)化，建立雙抗體夾心酶免疫測定方法。

1.3.4檢測方法評(píng)估以挑選的兩株抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，通過優(yōu)化抗體的稀釋比例，建立丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌檢測的雙抗體夾心檢測方法。將采用磷酸鹽緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋成一系列濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，空白孔做6個(gè)重復(fù)。以病菌濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的檢測吸光度值（OD450）值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定方法的線性范圍、檢測限和定量限。檢測限（LOD）的計(jì)算方式如下：以標(biāo)準(zhǔn)曲線中空白孔吸光度平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)的吸光值對(duì)應(yīng)的菌體濃度。定量限（QL）為空白孔吸光度平均值的2.1倍時(shí)的值對(duì)應(yīng)的菌體濃度。分別以水稻細(xì)菌性谷枯病菌，水稻細(xì)菌性條斑病菌，玉米細(xì)菌性枯萎病菌，丁香假單胞菌丁香致病變種菌株為測試菌，測試檢測方法的特異性。

2　結(jié)果與分析

2.1抗體的篩選配對(duì)

采用雜交瘤技術(shù)經(jīng)過融合篩選獲得6株對(duì)丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌有親和性的細(xì)胞株。分別將獲得的6種抗體作為包被抗體包被酶標(biāo)板，以HRP標(biāo)記抗體作為檢測抗體，配對(duì)篩選結(jié)果見表1。表中數(shù)據(jù)為P/N比值，可見采用1號(hào)抗體作為包被抗體，6號(hào)抗體作為檢測抗體（標(biāo)記HRP）配對(duì)，P/N值最高，為12.53。因此選擇1號(hào)抗體和6號(hào)抗體作為最優(yōu)配對(duì)抗體，建立雙抗體夾心免疫分析方法。

表1　丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌單克隆抗體篩選配對(duì)結(jié)果Table 1 Pairwish results of monoclonal antibodies aginst Pseudomonas syringae pv. Maculicola

2.2雙抗體夾心酶聯(lián)免疫測定方法建立

將包被抗體和檢測抗體進(jìn)行系列濃度稀釋，采用棋盤法進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果表明，當(dāng)包被抗體質(zhì)量濃度為4 μg/mL，檢測抗體質(zhì)量濃度為2 μg/mL，獲得最佳檢測敏感度。圖1為非線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出，檢測線性范圍在106～108cfu／mL之間，該方法檢測丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌的最低檢測限（LOD）為1.5×105cfu/mL，定量限（QL）為4.12～105cfu/mL。

用上述方法檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌、玉米細(xì)菌性枯萎病菌，丁香假單胞菌丁香致病變種病菌，450 nm下的吸光值（OD450）均在0.2以下，P/N值均小于2.1；表明該方法特異性較好，與上述病菌無交叉反應(yīng)，見表2。

圖1　雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1　 Standard curve of sandwich immunoassy for Pseudomonas syringae pv. maculicola

表2丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病毒的雙抗體夾心免疫法檢測特異性結(jié)果Table 2 Specificity tests of sandwich immunoassy for Pseudomonas syringae pv. Maculicola

3　結(jié)語

丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌是引起十字花科蔬菜黑斑病的重要植物病菌，可以通過種子傳播。目前對(duì)于植物病菌危害均采用分子生物學(xué)的分析方法，步驟繁瑣包括增菌培養(yǎng)、富集、菌體裂解提取DNA、PCR擴(kuò)增等多個(gè)步驟，效率較低。本研究采用免疫學(xué)方法，獲得了特異性的單克隆抗體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種病菌鑒定和快速檢測。該方法檢測丁香假單胞桿菌斑點(diǎn)致病變種的最低檢測限（LOD）為1.5×105cfu/mL，定量限（QL）為4.12×105cfu/mL，若增加增菌環(huán)節(jié)，有望大大提高檢測敏感度。本研究為研發(fā)植物病菌危害檢測提供了有力手段，為研發(fā)快速檢測試紙條等檢測產(chǎn)品提供了核心試劑和技術(shù)支撐，可用于口岸、現(xiàn)場植物病菌的鑒定和測試。

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Sandwich Immunoassy Against Pseudomonas syringae pv. Maculicola

WANG Wenbin，KONG Dezhao，TANG Lijuan，MA Wei，KUANG Hua*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：A sandwich immnuoassay based on monoclonal antibody for detection of Pseudomonas syringae pv. Maculicola was developed. Killed Pseudomonas syringae pv. Maculicola cell was used as immunogen to immunize BALB/c mice. The antisera was detected and the mice of highest antisera titer was selected for cell fusion. With hybirdoma technology，six cell lines secreting specific antibody to Pseudomonas syringae pv. Maculicola were obtained. Monoclonal antibodies（mAb）coded mAb1 and mAb6 were selected used as coating antibody and detection antibody based on pair-matching screening results. The sandiwich measure based on double antibodies were found to be high specific to targeted bacteria and no cross reactions to other bacteria including Burkholderia glumae，Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola，Pantoea stewartii subsp.stewartii and Pseudomonas syringae pv.syringae. Under optimized conditions，the limit of detection was 1.5×105cfu/mL andbook=163,ebook=56quantitative limit was 4.12×105cfu/mL. This immunoassy was highly specific to Pseudomonas syringae pv. Maculicola and suitable for in-field detction，which provide a convient and fast tool in plant bacteria analysis.

Keywords：immunoassay，Pseudomonas syringae pv. Maculicola，monoclonal antibody

*通信作者：匡華（1981—），女，河南長垣人，農(nóng)學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全方面的研究。E-mail：kuangh@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B07）。

收稿日期：2014-09-09

中圖分類號(hào)：S 436.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0162—04