王橋美，　楊瑞娟，　嚴(yán)　亮*，2，　劉　麗，　林　珊（.普洱茶研究院微生物實驗室，云南普洱665000，2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春3002）

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速溶普洱茶對紅茶菌飲料發(fā)酵的影響

王橋美1，楊瑞娟1，嚴(yán)亮*1，2，劉麗1，林珊1
（1.普洱茶研究院微生物實驗室，云南普洱665000，2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

摘要：對紅茶菌發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，以發(fā)酵液pH值和感官評分為衡量指標(biāo)，得到紅茶菌發(fā)酵最佳工藝條件是發(fā)酵基質(zhì)中加入紅糖，速溶普洱茶∶水=0.8 g∶1 000 mL，紅糖添加量為5.5 g時，紅茶菌發(fā)酵液pH值為3.7，紅茶菌飲料呈橙紅色，香氣好，口味酸甜適中，且產(chǎn)膜效率高，優(yōu)化工藝的微生物鑒定結(jié)果表明，紅茶菌是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生體，而且發(fā)現(xiàn)沒有報道過的微生物種類，這些微生物有利于紅茶菌的發(fā)酵且對人體有益。

關(guān)鍵詞：紅茶菌；速溶普洱茶；發(fā)酵；鑒定

紅茶菌又名“海寶”、“胃寶”，由木醋酸菌、酵母菌及乳酸菌共生而成的復(fù)合菌[1]，它在適宜溫度的糖茶水中可較好地生長，并能將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖，進一步轉(zhuǎn)化為麴酸、葡萄糖酸、醋酸、2—酮葡萄糖酸及酮醋酸等，使糖茶水生成一種酸甜可口的飲料[2]。紅茶菌是一種純天然微生物發(fā)酵飲料[3-4]，能調(diào)節(jié)人體某些生理機能，對許多疾病具有一定防治功效[5-6]。

紅茶菌以糖茶水為原料，經(jīng)過酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等多種微生物共同發(fā)酵而成。在紅茶菌中的菌種主要是醋酸菌和酵母菌，有些紅茶菌中有少量的乳酸菌。到目前為止[7]，從紅茶菌中分離出的醋酸菌有木醋桿菌（Acetobacter xylinum），擬木醋桿菌（A.xylinoides），葡萄糖酸桿菌（Bacterium gluconicum），產(chǎn)酮醋桿菌（A.ketogenum），弱氧化醋酸菌（A.suboxydans），葡萄糖醋酸菌（Gluconobacter liquefaciens），醋化醋桿菌（A.aceti），和巴氏醋桿菌（A.pasteurianus），其中最主要的是木醋桿菌（A. xylinum），酵母菌有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），不顯酵母（S.inconspicus），路德類酵母（S. ludwigii），粟酒裂殖酵母（Schizosaccharo-myces pombe），熱帶假絲酵母（Candida tropicans），克魯斯假絲酵母（C.crusei），漢遜德巴利酵母（Debarymyceshansenii），拜爾結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）等。乳酸菌在某些紅茶菌中存在，但不是必需菌種，主要有保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulagricum），嗜熱鏈球（Strepococcusthermop hilus），植物乳桿菌（L. plantarum）等[8-11]。

普洱茶不僅具有降脂保健功效[12-16]，而且據(jù)國內(nèi)外的諸多專家研究表明，普洱茶還具有降血糖、抗動脈硬化[17-20]等多種生理功能和藥效，云南普洱茶由大葉種曬青毛茶發(fā)酵得到，其中沒食子酸的含量也很高[20]，因此也同樣具有抗突變、抗腫瘤、抗菌以及消炎等諸多生物學(xué)功效。

紅茶菌是有著悠久歷史的一種民間傳統(tǒng)酸性飲料，目前國內(nèi)外對這樣一種保健飲品的研制方法也是方興未艾，特別是根據(jù)不同人的保健需求或口味要求進行改進或調(diào)整的制備方法，更是備受關(guān)注[21]。越來越多的新奇而又簡單的制作工藝紛紛被研制開發(fā)，其中以最為簡單的家庭培養(yǎng)方法最為引人注目。但是，由于家庭培養(yǎng)受到家庭中接種條件及培養(yǎng)溫度等條件的影響，容易受到雜菌污染，很難控制產(chǎn)品的質(zhì)量。因此探求一種簡單的制備方法和有效的菌種分離方法，是進一步深入研究紅茶菌的前提。作者用速溶普洱茶代替普洱茶湯來發(fā)酵紅茶菌飲料，既方便又省時，相比以往紅茶菌的發(fā)酵方法，這將是一種新興的發(fā)酵技術(shù)。將速溶普洱茶、蔗糖、水與紅茶菌種進行混合發(fā)酵，并對發(fā)酵液體中的微生物進行分離鑒定，探索速溶普洱茶對紅茶菌發(fā)酵的影響。結(jié)合對紅茶菌成分的單獨分析及其功能成分作用機理研究，旨在為下一步開發(fā)普洱茶相關(guān)的醋酸飲料的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅茶菌種：普洱茶研究院；速溶普洱茶：云南天士力生物茶科技有限公司；紅糖：市售食品級；白糖：市售食品級。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂18 g/L。

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂18 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

PB-21型酸度計；溫度計；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；相機；蘇凈安泰SW-CJ-2F型潔凈工作臺；376000型漩渦振蕩儀；威泰克掌上離心機；BS-30KA型電子天平；XS204型電子天平；9700型PCR儀；EM-308EB1型微波爐；dyy-6C型電泳儀；SYNGENE GBOX型凝膠成像系統(tǒng)；MDF-382E（N）超低溫冰箱；BCD-218SDA型冰箱；LGJ-1冷凍干燥機。

1.3方法

容器消毒：將培養(yǎng)罐、紗布、鑷子等先用洗潔精去除污漬，再用清水洗干凈，最后用煮沸的開水浸泡消毒，操作的環(huán)境盡量隔離，保證所用器具不能有污漬及霉菌孢子等的污染[22]；溫度的測定：每天早上十點與下午四點測溫度，算出每天平均值；酸度的測量：PB-21型酸度計；膜質(zhì)量的測量：紗布過濾后放在鋪有已消毒的自封袋型電子天平上稱量；菌液色香味、膜況采用直接觀察，菌液味符合發(fā)酵的正常味道，菌膜應(yīng)為透明膠狀膜，沉淀較少，菌液較清，呈現(xiàn)淡紅色或棕紅色。

紅茶菌凍干粉復(fù)蘇[23]：將凍干粉用無菌水稀釋，放入液體培養(yǎng)基中，能變渾濁即說明菌種已復(fù)蘇。

1.4發(fā)酵過程中菌種的分離和鑒定

1.4.1菌種的分離和純化從發(fā)酵罐中取出1 mL發(fā)酵液體裝入1.5 mL滅菌離心管中，用無菌水稀釋為10-4、10-5兩個梯度的菌懸液涂布到LB培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)72 h后對菌種進行拍照、計數(shù)、描述。挑取典型微生物單菌落進行劃線純化培養(yǎng)，并進行測序鑒定和菌種保存。

1.4.2菌種的鑒定將純化的真菌制成菌懸液[24]，真菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）體系（50 μL）如下：2×PCR緩沖液（buffer）（KOD DNA polymerase簡稱KOD FX）25 μL、2 mm脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy -ribonucleoside triphosphate簡稱dNTP）10 μL、KOD酶（1.0 U/μL）1 μL、上游引物（10 μmol/L）2 μL、下游引物（10 μmol/L）2 μL、菌懸液1.5 μL、水8.5 μL；PCR反應(yīng)條件：1）預(yù)變性94℃5 min；2）變性98℃10s；3）復(fù)性（退火）50℃30 s；4）延伸68℃2 min，步驟（2～4）循環(huán)45次；5）4℃保溫；上游引物NL1F：5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3′；下游引物L(fēng)S2R：5′ATTCCCAAACAACTCGACTC 3′。

將純化的細(xì)菌制成菌懸液[25]，細(xì)菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）體系（50 μL）如下：10×Taq緩沖液（buffer）5 μL、2 mm脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate簡稱dNTP）5 μL、Taq聚合酶（Taq polymerase簡稱Taq酶）（5.0 U/μL）1 μL、上游引物（10 μmol/L）2 μL、下游引物（10 μmol/L）2 μL、菌懸液2 μL、水33 μL；PCR反應(yīng)條件：1）預(yù)變性94℃5 min；2）變性96℃30 s；3）復(fù)性（退火）52℃30 s；4）延伸72℃50 s，步驟（2～4）循環(huán)35次；5）72℃延伸10 min；6）4℃保溫；上游引物R1492：5′TACGGYTACCTTGTT ACGACTT 3′；下游引物F27：5′AGAGTTTGATCMT GGCTCAG 3′。

將PCR擴增產(chǎn)物送至廣州華大基因測序，根據(jù)測序結(jié)果，用每個菌株的ITS1基因作為靶序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中用在BLAST（Basic Local Alignmen Search Tool）程序來搜索同源序列，挑選與靶系列最相近的參考菌株系列，查出相應(yīng)微生物，完成菌種鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1不同添加量的速溶普洱茶對紅茶菌發(fā)酵中pH值、成膜情況及品質(zhì)的影響

2.1.1發(fā)酵過程中紅茶菌液的pH變化純凈水加熱至100℃，奇數(shù)罐加入5.5 g/dL的紅糖，偶數(shù)罐加入6.5 g/dL的白糖，10-1，10-3，10-5，10-7，10-9和10-2，10-4，10-6，10-8，10-10罐速溶普洱茶添加量分別為0、0.05、0.08、0.18、0.35 g/dL。把發(fā)酵室溫度控制在24～28℃，測量每個發(fā)酵罐的pH值，測量周期為8 d，隨著時間不同pH的變化見圖1—2。

圖1　速溶普洱茶、紅糖對紅茶菌發(fā)酵pH值的影響Fig. 1 Effect of brown sugar，instant pu-erh tea content on pH　 value of kombucha

圖2　速溶普洱茶、白糖對紅茶菌發(fā)酵pH值的影響Fig. 2 Effect of white sugar，instant pu-erh tea content on pH value of kombucha

圖1和圖2的變化趨勢大致相同，不同添加量的速溶普洱茶對紅茶菌發(fā)酵液中pH的影響也不太明顯，變化趨勢基本一致，發(fā)酵1～2 d左右pH值下降迅速，4 d以后趨于平穩(wěn)，pH值為3.7左右。說明速溶普洱茶添加量對pH值的影響較小，加入紅糖的發(fā)酵罐起始pH較接近最適值，說明加入紅糖的pH更利于紅茶菌的發(fā)酵。

2.1.2不同添加量的速溶普洱茶對口味及成膜的影響純凈水加熱至100℃，奇數(shù)罐加入5.5 g/dL的紅糖，偶數(shù)罐加入6.5 g/dL的白糖，10-1，10-3，10-5，10-7，10-9和10-2，10-4，10-6，10-8，10-10罐速溶普洱茶添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.05%、0.08%、0.18%、0.35%，培養(yǎng)周期一個月，結(jié)果見表1—2。

表1　速溶普洱茶、紅糖對紅茶菌飲料感官品質(zhì)的影響Table 1 Effect of brown sugar，instant pu-erh tea content on sensory quality of kombucha

表2　速溶普洱茶、白糖對紅茶菌飲料感官品質(zhì)的影響Table 2 Effect of white sugar，instant pu-erh tea content on sensory quality of kombucha

由上可知，10-9，10-10兩罐速溶普洱茶的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.35%，這兩罐都沒有形成菌膜，說明速溶普洱茶加入到一定量會抑制菌膜的形成，這與加入糖的種類無關(guān)。10-5，10-6兩罐加入的速溶普洱茶量均為0.08%，這兩罐的色澤、氣味、組織狀態(tài)、口感等各個指標(biāo)都比較好，說明加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%的速溶普洱茶最適合紅茶菌的發(fā)酵。對比紅糖、白糖對紅茶菌飲料的色澤及口感的影響可以看出，加入紅糖發(fā)酵的紅茶菌飲料口感較好，說明紅糖更適合紅茶菌飲料的發(fā)酵。

2.1.3不同發(fā)酵條件對紅茶菌膜生長的影響10-1，10-5罐為紅糖培養(yǎng)的紅茶菌，10-2，10-6罐為白糖培養(yǎng)的紅茶菌，10-1，10-2罐的速溶普洱茶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、10-5，10-6罐的速溶普洱茶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%。以10-1，10-2為空白對照，對膜質(zhì)量的變化進行比較，旨在得到產(chǎn)率較高的發(fā)酵條件，初始加入菌膜質(zhì)量均為300 g，發(fā)酵一個月后，紅茶菌膜質(zhì)量變化見表3。

表3　不同發(fā)酵條件對紅茶菌膜生長的影響Table 3 Effect of different fermentation conditions on kombucha membrane

由表3可知，10-2和10-6的質(zhì)量遠遠小于10-1和10-5的質(zhì)量，說明紅糖培養(yǎng)紅茶菌的產(chǎn)膜量比白糖培養(yǎng)的高；10-5的膜質(zhì)量遠比10-1的膜質(zhì)量高，說明加入速溶普洱茶更有利于膜的生長。從而得到最適合紅茶菌生長的條件為：5.5 g/dL紅糖，0.08 g/dL的速溶普洱茶。

2.2紅茶菌液中的微生物分離鑒定結(jié)果

2.2.1用速溶普洱茶發(fā)酵的紅茶菌液中的微生物分離鑒定由表4可知，通過分子測序鑒定出的菌株主要歸屬于酵母菌、醋酸菌、乳酸菌三類菌，除此之外，還鑒定出了部分菌種是紅茶菌發(fā)酵中未見報道的，如：Bacillus flexus，Kocuria rosea，Leclercia adecarboxylatan，Enterobacter sp.，Streptomyces albiaxialis，Bacilluscereus，Bacillusnealsonii，Burgellaflavoparmeliae，SpHingomonas sp.還有一些是對身體極為有益的，如Bacillus flexus可以產(chǎn)生堿性淀粉酶；Rhodotorula mucilaginosa粘質(zhì)紅酵母，可以產(chǎn)生脂肪，丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸；Leuconostoc mesenteroides是一種乳酸桿菌，廣泛應(yīng)用于食品飲料及酒產(chǎn)業(yè)中。Phingomonas sp.鞘氨醇單胞菌屬，是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解。

表4　速溶普洱茶發(fā)酵的紅茶菌液中的微生物Table 4 Composing of microorganisms during kombucha fermentation

2.2.2紅茶菌表層絮狀物微生物鑒定結(jié)果在添加速溶普洱茶紅茶菌發(fā)酵過程中，紅茶菌膜的表層有一層白色絮狀物，是一般紅茶菌發(fā)酵過程中不存在的，初步分析是發(fā)酵過快導(dǎo)致，對其中的微生物做鑒定，結(jié)果見表。

由表5可知，表層絮狀物里含有的微生物有Acetobacter fabarum，Enterobacter aerogenes，Pichia kudriavzevii，Pichia kluyveri，Wickerhamomyces anomalus等，主要是酵母和醋酸桿菌及產(chǎn)氣腸桿菌，不存在對人體有害的微生物。亦可以發(fā)現(xiàn)，白糖發(fā)酵表層絮狀物里只發(fā)現(xiàn)了Pichia kluyveri，Wicker -hamomyces anomalus兩種酵母，而紅糖發(fā)酵表層絮狀物里還發(fā)現(xiàn)了Acetobacter fabarum，Enterobacter aerogenes，Pichia kudriavzevii等微生物，種類要比白糖發(fā)酵得到的多，得知紅糖更利于紅茶菌的發(fā)酵。

2.2.3紅茶菌凍干粉復(fù)蘇后的微生物種類將凍干的紅茶菌膜復(fù)蘇后，對其中微生物的分離鑒定結(jié)果見表6。

表5　速溶普洱茶發(fā)酵紅茶菌表層絮狀物微生物Table 5 Composing of microorganisms on surface of kombucha floc

表6　紅茶菌凍干粉中的微生物Table 6 Composing of microorganisms in lyophilized powder of Kombucha

由表6可知，紅茶菌膜里含有的微生物主要是酵母和醋酸桿菌類，另外還分離到Enterobacter sp. 和Streptomyces albiaxialis兩類特殊的菌株，結(jié)果與凍干前紅茶菌膜中的微生物一致。

3　結(jié)語

本研究結(jié)果表明：紅茶菌的發(fā)酵pH降到3.7左右基本趨于恒定，且不同添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的速溶普洱茶對紅茶菌發(fā)酵液中pH的影響差別都不太明顯。此結(jié)果與蔣立文[26]的研究結(jié)果一致；加入紅糖的培養(yǎng)基中膜的產(chǎn)量要比加入白糖的產(chǎn)量高，且相同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間下，口味較好，外觀較透明，這可能與紅糖內(nèi)含有較多的葡萄糖（比白糖要多20～30倍），較豐富的鐵質(zhì)（比白糖多一倍），還含有白糖所沒有的胡蘿卜素、核黃素、煙酸等有關(guān)系。不同添加量的速溶普洱茶對紅茶菌的成膜速度及品質(zhì)有一定的影響，速溶普洱茶加入到一定量以后會抑制菌膜的形成，但與加入糖的種類無關(guān)。當(dāng)發(fā)酵罐中紅糖∶速溶普洱茶∶水為5.5 g∶0.8 g∶1 000 mL時，發(fā)酵得到橙紅、醋香、酒香、透明、潤滑的紅茶菌飲料，而且產(chǎn)膜效率也最高。此結(jié)果說明，加入速溶普洱茶和糖的種類不同都會影響紅茶菌發(fā)酵。通過對比白糖與紅糖種類的不同和速溶普洱茶添加量的不同，得到了最適合普洱茶紅茶菌發(fā)酵的條件，因此可以考慮生產(chǎn)紅糖普洱茶制作的紅茶菌飲品。

發(fā)酵過程中對發(fā)酵液的微生物分離鑒定結(jié)果表明，用速溶普洱茶與紅糖或白糖發(fā)酵紅茶菌產(chǎn)生的微生物除了酵母菌、醋酸菌、乳酸菌三類外，還分離鑒定出了其他多種菌種，有部分菌種是紅茶菌發(fā)酵中未見報道的，比如：Bacillus flexus，Kocuria rosea，Leclercia adecarboxylata，Enterobacter sp.，Streptomyces albiaxialis，Bacillus cereus，Bacillus nealsonii，Burgella flavoparmeliae，SpHingomonas sp.還有一些是對身體極為有益的，如Bacillus flexus可以產(chǎn)生堿性淀粉酶；Rhodotorula mucilaginosa粘質(zhì)紅酵母，可以產(chǎn)生脂肪和丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸；Leuconostoc mesenteroides是一種乳酸桿菌，廣泛應(yīng)用于食品飲料及酒產(chǎn)業(yè)中。pHingomonas sp.鞘氨醇單胞菌屬，是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解。

作者證實了紅茶菌是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生體，并用速溶普洱茶代替普洱茶湯發(fā)酵紅茶菌飲料，既方便又省時，在紅茶菌的發(fā)酵過程中加入普洱速溶普洱茶，更利于紅茶菌的發(fā)酵且對人體更有益；還對比了紅糖與白糖對紅茶菌發(fā)酵的影響，證明了紅糖更利于紅茶菌的發(fā)酵；通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法，鑒定得到了多種未在紅茶菌發(fā)酵中報道過的微生物[22]，為進一步對紅茶菌中微生物的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Instant Pu'er Tea Content on Kombucha Fermentation

WANG Qiaomei1，YANG Ruijuan1，YAN Liang*1，2，LIU Li1，LIN Shan1
（1. Microbiology Laboratory，Pu'er Institute of Pu'er Tea，Pu'er 665000，China；2. College of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China）

Abstract：Kombucha Fermentation conditions wereoptimized by pH value and sensory scores.，The fermentation substrates werebrown sugar，and the instant pu-erh tea：water was at 0.8 g∶1 000 mL. when brown sugar content was at 5.5 g and the pH value was at 3.7，the Kombucha beverage was orange，Pleasant aroma，moderate sweet and sour taste，also showed high membrane yield. The microbial results in optimization technique showed that Kombucha was composed of yeast，acetic acid bacteria and lactic acid bacteria. This study discovered new microorganisms which werebeneficial for Kombucha fermentation and human health.

Keywords：kombucha，instant pu-erh tea，fermentation，identification

*通信作者：嚴(yán)亮（1983—），男，吉林長春人，理學(xué)博士，助理研究員，主要從事細(xì)胞生物學(xué)方面的研究。E-mail：jacky_4680@163.com

作者簡介：王橋美（1985—），女，云南尋甸人，農(nóng)學(xué)碩士，助理研究員，主要從事食品微生物方面的研究。E-mail：wangqiaomei114@163.com

基金項目：云南省科技創(chuàng)新強省計劃項目（2008QA028）。

收稿日期：2014-07-04

中圖分類號：TS 272

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0197—08