楊道強，　陸勝民，　夏其樂，　鄭美瑜，　周錦云（.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州3002；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華32004）

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靈芝酒浸提過程中主要功能成分的變化及抗氧化作用研究

楊道強1，2，陸勝民*1，夏其樂1，鄭美瑜1，周錦云1
（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州310021；2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

摘要：以靈芝子實體超細(xì)粉為原料，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液浸提，對靈芝酒浸提過程中主要功能成分的變化規(guī)律及其抗氧化作用進行了研究。結(jié)果表明：靈芝酒中總皂苷、總多糖和總蛋白質(zhì)3種主要活性成分的質(zhì)量濃度均隨浸提時間的延長而增加，其中總皂苷、總多糖的質(zhì)量濃度在第35天左右達(dá)到峰值，之后略有下降，總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在第30天左右達(dá)到峰值，之后開始降低；靈芝酒的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率在第35天左右達(dá)到最大值，其抗氧化能力與總皂苷質(zhì)量濃度、總多糖質(zhì)量濃度和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)；浸提用酒度數(shù)不同，制得靈芝酒的活性成分質(zhì)量濃度不同，其抗氧化能力也不同，其中70°酒能較好地提取靈芝中3種主要活性成分，制得靈芝酒的抗氧化能力最強。因此，70°酒最適宜用來浸提靈芝酒，最佳浸提時間為35 d左右。

關(guān)鍵詞：靈芝浸泡酒；總皂苷；總多糖；總蛋白；抗氧化

靈芝是一種名貴的藥用真菌，屬于靈芝菌科靈芝屬，素有“仙草”之美譽，在我國有著悠久的藥用歷史。《本草綱目》中對靈芝記載道：主治耳聾，利關(guān)節(jié)，保神，益精氣，堅筋骨，好顏色，久服輕身不老，延年、療虛勞、治痔[1]。靈芝富含多種活性成分，如活性蛋白、多糖、三萜及皂苷類化合物、核苷酸、生物堿等[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝活性成分對人體的神經(jīng)、免疫、心血管等系統(tǒng)都具有較好的調(diào)節(jié)作用，尤其對保護肝臟、抑制腫瘤、防止失眠、抗衰老具有顯著效果，且無毒副作用[3-5]，此外還具有抑制膽固醇合成、抗菌、消炎、抗病毒等諸多藥理作用[6-7]。

靈芝作為一種具有多種保健功效的珍貴中藥，已廣泛應(yīng)用于各種保健食品[8]。目前國內(nèi)外利用靈芝開發(fā)的保健品主要有靈芝孢子油、靈芝蜂蜜茶、靈芝人參酒等[9]，其中對靈芝浸泡酒的研究主要集中在工藝上，而關(guān)于靈芝主要功能成分溶出過程的動態(tài)分析還未見報道。作者以靈芝子實體超細(xì)粉為原料，以不同酒精度的食用乙醇浸提，研究了靈芝酒在浸提過程中主要功能成分的變化及其抗氧化作用，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的靈芝保健酒提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1原料和試劑

1.1.1原料靈芝超細(xì)粉（產(chǎn)品原料為純赤靈芝子實體）：購于浙江省農(nóng)科院園藝所食藥用菌研發(fā)中心。

1.1.2試劑95%食用乙醇：浙江省食品工業(yè)總公司；人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）標(biāo)準(zhǔn)品、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海江萊生物科技有限公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G-250：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；DPPH（2，2 -diphenyl -1 -picrylhydrazyl、ABTS（2，2 -azinobis -3 -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）：Sigma公司；磷酸、濃硫酸、高氯酸、苯酚、冰乙酸、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、香草醛等：均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1800紫外/可見分光光度計：日本島津公司；AL104-IC電子天平：梅特勒-托利多（上海）儀器公司；LXJ-IIB型離心機：上海諾頂儀器設(shè)備有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1浸提方法設(shè)定3種不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)：52%、70%、95%，每份乙醇溶液用量500 mL，靈芝超細(xì)粉100 g，將靈芝超細(xì)粉與乙醇溶液混合后，搖晃均勻，靜置，常溫避光保存。定期取酒樣分析總皂苷、總多糖、總蛋白質(zhì)及其抗氧化指標(biāo)，取樣時間間隔為5 d。

1.3.2測定方法總皂苷質(zhì)量濃度測定[10]：精確稱取人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4℃冰箱中保存，備用。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于具塞試管中，水浴加熱揮發(fā)去除溶劑，再分別加入新配置的5 g/dL香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，于60℃水浴中加熱15 min，冰浴冷卻后，各加入冰乙酸5 mL，放置15 min后于545 nm處測定吸光度，用甲醇作為空白對照。以標(biāo)準(zhǔn)品取樣量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y＝0.003 4X－0.002 9，R2＝0.999 6。測定樣品時，量取適量待測液，適當(dāng)稀釋后取1.0 mL代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述方法以甲醇為空白，在545 nm處測定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中皂苷的質(zhì)量并計算其質(zhì)量濃度。

總多糖質(zhì)量濃度測定：參考石鳳敏等[11]的方法，略加修改。準(zhǔn)確稱取于105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加水溶解并定容至50 mL搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于15 mL具塞試管中，并加水至2 mL，再分別加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻后于沸水中水浴20 min，取出后冰浴冷卻10 min。以不加標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑為空白對照，在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y＝0.006 5X－0.000 1，R2＝0.999 4。測定樣品時，取適量樣液，蒸發(fā)濃縮，調(diào)整最終乙醇體積分?jǐn)?shù)至80%，4℃冰箱放置過夜，離心，傾去上清液，所得沉淀用無水乙醇洗滌兩次，加水溶解并適當(dāng)稀釋。取稀釋后的樣液1 mL和蒸餾水1 mL至15 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的操作，測定吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量并計算其質(zhì)量濃度。

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定[12]：參考考馬斯亮藍(lán)G-250法，準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白10.0 mg，用蒸餾水溶解并定容至100 mL得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)液，于4℃冰箱中保存。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于15 mL具塞試管中，加水補充至1 mL，加考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，靜置15 min，在波長595 nm處測定其吸光度值。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y＝0.008 5X+0.009 9，R2＝0.999 3。將樣品液適當(dāng)稀釋，取1 mL加考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，室溫靜置15 min，于波長595 nm讀取吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

ABTS自由基清除率測定[13]：取適當(dāng)稀釋后的樣品溶液0.1 mL，加入4 mL ABTS自由基反應(yīng)液，避光靜置6 min，在734 nm處測定吸光度值A(chǔ)i；另設(shè)一空白，樣液用無水乙醇代替，在734 nm處測定吸光度值A(chǔ)0。ABTS自由基清除率計算公式：

DPPH自由基清除率測定[14-15]：將樣品液適當(dāng)稀釋，按表1數(shù)據(jù)加樣，混勻后于暗處靜置30 min，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm處測定吸光度值。清除率計算公式：

表1　DPPH自由基清除實驗Table 1 Experiment of scavenging DPPH·

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2010和SPSS Statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，每組重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0進行相關(guān)性分析和差異分析，P＜0.05表明差異顯著，P＜0.01表明差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1靈芝酒浸提過程中總皂苷質(zhì)量濃度的變化

由圖1可知，乙醇浸提時間及酒精度均會影響靈芝中總皂苷的溶出。在40 d的浸提時間內(nèi)，3種靈芝酒中總皂苷質(zhì)量濃度均隨著浸提時間的延長而增加，35 d之后不再增加，甚至略有降低。這可能是因為原料顆粒內(nèi)部溶質(zhì)的溶解擴散較慢，時間延長有利于皂苷的溶出，酒中總皂苷質(zhì)量濃度增加；但隨著時間的進一步延長，固液兩相中的皂苷質(zhì)量濃度逐漸趨于平衡，液相中皂苷質(zhì)量濃度不再增加[16]，同時皂苷會發(fā)生水解，因而質(zhì)量濃度降低。三種靈芝酒中總皂苷質(zhì)量濃度也均不相同，隨著浸提用酒的酒精度提高，靈芝中的總皂苷溶出增加，酒中的總皂苷質(zhì)量濃度隨之升高。

圖1　靈芝酒浸提過程中總皂苷質(zhì)量濃度的變化Fig. 1　 Change of total saponin content in Ganoderma lucidum wine during extraction

2.2靈芝酒浸提過程中總多糖質(zhì)量濃度的變化

由圖2可知，3種靈芝酒中總多糖質(zhì)量濃度均先增加，在第35天左右達(dá)到最大值，之后略有降低。隨著浸提時間的延長，酒精溶液可充分滲透到靈芝組織細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)多糖充分接觸并使之溶解[17]，從而使酒中總多糖質(zhì)量濃度增加，但浸提時間過長，部分多糖會被氧化或發(fā)生水解，因而導(dǎo)致酒中總多糖的質(zhì)量濃度降低。由圖2還可以看出，3種靈芝酒中總多糖質(zhì)量濃度隨浸提用酒的酒度升高而降低。靈芝多糖種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，絕大部分能溶于水，而不溶于高度酒精[17]。浸提用酒的酒精度越低，其水含量越高，則其溶解的靈芝多糖就越多；而酒精度越高，大多數(shù)靈芝多糖不被溶出，甚至沉淀析出，因而浸提酒中的多糖質(zhì)量濃度越低。

圖2　靈芝酒浸提過程中總多糖質(zhì)量濃度的變化Fig. 2　 Change of total polysaccharides content in Ganoderma lucidum wine during extraction

2.3靈芝酒浸提過程中總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化

靈芝中含有多種類型的蛋白質(zhì)，包括糖蛋白、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、凝集素、酶等[18]，其中既有水溶性蛋白質(zhì)又有醇溶性蛋白質(zhì)。由圖3可知，隨著浸提時間的延長，3種靈芝酒中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均先增加，在25～30 d達(dá)到峰值，之后開始下降。浸提時間的延長可使更多的靈芝蛋白質(zhì)溶解到酒中，因此酒中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度增加，但浸提時間過長，溶解到酒中的蛋白質(zhì)則會發(fā)生分解、變性，從而導(dǎo)致其質(zhì)量濃度下降。浸提用酒的酒精度不同，酒中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度也不相同，其中以70°酒浸提的最高，95°酒的次之，而52°酒的最低。不同度數(shù)的浸提用酒，因其中水和乙醇的比例不同，對水溶性蛋白和醇溶性蛋白的提取能力也不同。敖宏[19]的研究表明，靈芝醇溶性蛋白質(zhì)的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，其中以70%乙醇對醇溶性蛋白質(zhì)的提取率最高，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進一步提高，醇溶性蛋白的提取率反而下降。70°酒浸提所得靈芝酒中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最高，可能是因為其既能充分地提取醇溶性蛋白質(zhì)又能較好地溶解水溶性蛋白質(zhì)。

圖3　靈芝酒浸提過程中總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化Fig. 3　 Change of total protein content in Ganoderma lucidum wine during extraction

2.4靈芝酒浸提過程中DPPH·清除能力的變化

DPPH自由基以氮為中心，較為穩(wěn)定，對其清除率的高低常被用來評價抗氧化能力的強弱。靈芝皂苷、多糖、蛋白質(zhì)等活性成分均具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基的清除能力也較強[17，19-20]，靈芝酒因富含這些活性成分而具有較強的抗氧化性能。由圖4可知，3種靈芝酒對DPPH自由基的清除率隨著浸提時間的延長而增加，在30～35 d達(dá)到最大值，之后開始下降，這與酒中皂苷、多糖、蛋白質(zhì)等活性成分質(zhì)量濃度變化的趨勢一致。由圖4還可以看出，不同度數(shù)的靈芝酒對DPPH自由基的清除能力也不同。70°酒浸提所得靈芝酒中靈芝皂苷、多糖、蛋白質(zhì)3種主要活性成分質(zhì)量濃度總和最高，因此其對DPPH自由基的清除率也最高，在浸提35 d時，清除率高達(dá)（82.7±0.3）%。

2.5靈芝酒浸提過程中ABTS·清除能力的變化

ABTS自由基清除能力也是考察抗氧化性能的指標(biāo)之一，目前關(guān)于靈芝活性成分ABTS自由基清除能力的相關(guān)研究較少。由圖5可知，3種靈芝酒對ABTS自由基的清除率在浸提初期迅速增加，在20 d以后波動較小，基本保持平穩(wěn)趨勢，在30～35 d后開始下降。不同度數(shù)的靈芝酒ABTS自由基的清除能力也不同，這與酒中溶解的靈芝抗氧化活性成分質(zhì)量濃度有關(guān)。同樣，70°酒浸提所得靈芝酒的ABTS自由基清除能力最強，在浸提35 d時，清除率最高，達(dá)（80.5±0.8）%。

圖4　靈芝酒浸提過程中DPPH·清除能力的變化Fig. 4　 Change of DPPH radical scavenging activity of Ganoderma lucidum wine during extraction

圖5　靈芝酒浸提過程中ABTS·清除能力的變化Fig. 5　 Change of ABTS radical scavenging activity of Ganoderma lucidum wine during extraction

2.6靈芝酒抗氧化能力與各活性成分質(zhì)量濃度相關(guān)性分析

靈芝酒的抗氧化能力是溶在其中的皂苷、多糖、蛋白質(zhì)等多種活性成分綜合作用的結(jié)果。由表2可見，52°酒浸提所得靈芝酒的DPPH自由基清除率與總皂苷質(zhì)量濃度、總多糖質(zhì)量濃度均呈極顯著正相關(guān)，與總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度相關(guān)性不顯著；ABTS自由基清除率與3種主要活性成分質(zhì)量濃度均呈顯著正相關(guān)。70°酒浸提所得靈芝酒的DPPH自由基清除率與總皂苷質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)，與總多糖質(zhì)量濃度和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均呈顯著正相關(guān)；ABTS自由基清除率與3種主要活性成分質(zhì)量濃度均呈極顯著正相關(guān)。95°酒浸提所得靈芝酒的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率與總皂苷質(zhì)量濃度、總多糖質(zhì)量濃度相關(guān)性不顯著，但均與總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)?？傮w上看，3種靈芝酒的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率與總皂苷質(zhì)量濃度、總多糖質(zhì)量濃度和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)。因此，靈芝酒中皂苷、多糖和蛋白質(zhì)3種主要活性成分質(zhì)量濃度越高，其營養(yǎng)價值越高，保健作用越好。

表2　靈芝酒抗氧化能力與各活性成分質(zhì)量濃度相關(guān)系數(shù)Table 2　 Correlation coefficient of antioxidant activity of Ganoderma lucidum　 wine and its active component concentration（mg/mL）

3　結(jié)語

靈芝酒中總皂苷、總多糖和蛋白質(zhì)3種主要活性成分的質(zhì)量濃度均隨浸提時間的延長而增加，總皂苷、總多糖的質(zhì)量濃度在第35天左右達(dá)到峰值，之后略有下降，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在第30天左右達(dá)到峰值，之后開始降低。

靈芝酒的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率在第35天左右達(dá)到最大值。靈芝酒的抗氧化能力與總皂苷質(zhì)量濃度、總多糖質(zhì)量濃度和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均呈正相關(guān)。

浸提用酒度數(shù)不同，制得靈芝酒中的活性成分質(zhì)量濃度不同，其抗氧化能力也不同。70°酒能較好地提取靈芝中3種主要活性成分，制得靈芝酒的抗氧化能力最強。綜合來看，70°酒最適宜用來浸提靈芝酒，最佳浸提時間為35 d左右。

本研究使用靈芝粉浸提制備靈芝酒，浸提速度快、效率高。以不同體積分?jǐn)?shù)的食用乙醇浸提，研究了靈芝酒在浸提過程中主要功能成分的變化規(guī)律及靈芝酒的抗氧化作用，為開發(fā)營養(yǎng)、保健的優(yōu)質(zhì)靈芝酒提供了理論依據(jù)，但未對靈芝酒的感官品質(zhì)做系統(tǒng)評價，因此要得到一款具有市場價值的靈芝保健酒，可能需要對其口感等進行調(diào)配，其感官品質(zhì)仍需進一步研究。

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Changes of the Main Functional Components and Antioxidant Capacity of Ganoderma lucidum Wine during the Extraction with Ethanol Solution

YANG Daoqiang1，2，LU Shengmin*1，XIA Qile1，ZHENG Meiyu1，ZHOU Jinyun1
（1. Food Science Institute，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China；2. College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Abstract：Ganoderma lucidum powder was extracted by ethanol solution of different concentration and the changes of the main functional components and antioxidant capacity of Ganoderma lucidum wine during extraction were studied. The results showed that the content of the total saponin，polysaccharides and protein were increased with time. The content of total saponin and total polysaccharides reached the peak at the 35 th day and then was declined slightly，and the content of total protein was declined after 30 days when it reached the peak. DPPH radical scavenging activity and ABTS radical scavenging activity reached the peak at the 35 th day. Positive correlation was found between antioxidant capacity and the content of total saponin，total polysaccharides and totalbook=206,ebook=99protein. The antioxidant capacity and the content of functional components of Ganoderma lucidum wine varied with the concentration of ethanol solution used to extract Ganoderma lucidum for wine. The three main functional components could be extracted well with 70% ethanol solution，and the antioxidant capacity of the wine was the highest. So the best concentration of ethanol solution to extract Ganoderma lucidum for wine was 70%，and the best extraction time was about 35 days.

Keywords：Ganoderma lucidum steeping wine，total saponin，total polysaccharides，total protein，antioxidant

*通信作者：陸勝民（1969—），男，浙江蘭溪水人，工學(xué)博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工與綜合利用方面的研究。E-mail：lushengmin@hotmail.com

基金項目：浙江省農(nóng)科院創(chuàng)新能力提升項目（2014CX011）。

收稿日期：2014-09-09

中圖分類號：Q 55

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）02—0205—06