林　紅（江蘇省連云港市中醫(yī)院　連云港　222000）

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洋川芎內(nèi)酯A對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究

林紅（江蘇省連云港市中醫(yī)院連云港222000）

摘要：目的：探討洋川芎內(nèi)酯A對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法：將60只雄性健康SD大鼠隨機分為4組，分別為：假手術(shù)組（Sham，n=15），模型組（CTL，n=15），洋川芎內(nèi)酯A低劑量組（ASE-L，n=15）和洋川芎內(nèi)酯A高劑量組（ASE-H，n= 15），大鼠腦缺血90min后恢復(fù)血流，于大腦中動脈阻斷（MCAO）后24h將大鼠處死，對各組腦組織中IL-1β、IL-6、MDA水平以及SOD活性進行測定，并對各組的缺血側(cè)腦水腫指數(shù)、腦梗死體積以及神經(jīng)功能評分進行比較。結(jié)果：與CTL組比較，給藥組大鼠的腦水腫指數(shù)、腦梗死體積以及神經(jīng)功能評分明顯改善，高劑量組（ASE-H）明顯優(yōu)于低劑量組（ASE-L），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；同時，給藥組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6、MDA水平明顯降低，SOD活性明顯提高，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：圍術(shù)期采用洋川芎內(nèi)酯A預(yù)處理可明顯減輕腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制促炎因子釋放，對于腦缺血再灌注引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有明顯保護作用。

關(guān)鍵詞：洋川芎內(nèi)酯A腦缺血再灌注氧化應(yīng)激炎癥

腦血管病是臨床多發(fā)和常見疾病之一，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘和致死率高的特點，近年來逐漸趨于年輕化，對患者的工作和生活造成嚴(yán)重影響，也給患者家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)[1]。在缺血性腦血管病的臨床康復(fù)治療中，迅速恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是避免腦組織損傷的決定性因素，但是同時帶來的再灌注損傷也是亟待解決的熱點問題。研究資料顯示[2]，腦缺血再灌注損傷發(fā)生的病理機制存在多種，包括過度釋放興奮性氨基酸、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及細胞凋亡等，各種因素相互作用，最終導(dǎo)致組織的不可逆性損傷。近年來的臨床應(yīng)用和實驗研究結(jié)果表明，中藥及中藥活性成分在腦缺血再灌注損傷的治療方面具有明顯的優(yōu)勢。在本文中我們對洋川芎內(nèi)酯A預(yù)處理對于局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制進行探討，現(xiàn)總結(jié)和報道如下：

1　實驗材料

1.1實驗動物：雄性健康SD大鼠共60只，體重范圍220～300g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：蘇SYXK 20150042。動物自由采食和飲水，室溫為（24±2）℃，濕度為55%。

1.2實驗試劑：洋川芎內(nèi)酯A由江蘇省藥物研究所化學(xué)室提供；IL-1β ELISA檢測試劑盒、IL-6 ELISA檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒以及超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

2　實驗分組

將60只雄性健康SD大鼠隨機分為4組，每組分別15只。分別為：假手術(shù)組（SHAM），行頸部切口，暴露20min后關(guān)閉，術(shù)前予以生理鹽水灌胃7d；模型組（CTL）：術(shù)前連續(xù)予以等量生理鹽水灌胃7d，后行大腦中動脈阻斷術(shù)（MCAO）；洋川芎內(nèi)酯A低劑量組（ASE-L）：術(shù)前7d連續(xù)予以洋川芎內(nèi)酯A 20mg/kg灌胃，均于給藥當(dāng)天新鮮配制；洋川芎內(nèi)酯A高劑量組（ASE-H）：術(shù)前7d連續(xù)予以洋川芎內(nèi)酯A 40mg/kg灌胃，均于給藥當(dāng)天新鮮配制。

3　動物處理

模型動物均以戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射進行麻醉，行大腦中動脈阻斷術(shù)（MCAO），于阻斷90min后再次麻醉，拔出線栓恢復(fù)血流，建立局灶性缺血-再灌注損傷模型。24h后取CTL、ASE-L、ASE-H組以及SHAM組大鼠各8只處死，經(jīng)心臟灌注后取梗死側(cè)組織半影區(qū)于-70℃下凍存；各組其余大鼠行神經(jīng)功能評分后處死，取全腦進行切片、染色后測量梗死側(cè)體積和水腫指數(shù)。

4　評價方法

4.1腦梗死檢測：切片以顯微鏡拍照后采用Image J軟件進行分析。梗死體積（%）=（對側(cè)正常組織體積—同側(cè)正常組織體積）/對側(cè)正常組織體積×100%；腦水腫指數(shù)=缺血側(cè)體積/非缺血側(cè)體積。

4.2神經(jīng)功能評分：采用7分法進行神經(jīng)功能評分[3]：意識和活動正常為0分；前肢無法完全伸展為1分；對側(cè)前肢無法攀援為2分；自動向各方向轉(zhuǎn)圈為3分；自動連續(xù)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為4分；刺激時才移動為5分；對刺激無反應(yīng)為6分；死亡為7分。

4.3 ELISA檢測：取凍存的腦組織，以Tris-HCl（pH7.3）20mmol/L進行勻漿后，于4℃下以4000r/min離心10min后取上清液，再于4℃下以10000r/min超高速離心2h后，分別按照IL-1β、IL-6、MDA和SOD的檢測試劑盒的操作說明進行檢測。

5　統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS15.0軟件進行處理和分析，數(shù)據(jù)均以（±s）的方式表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析ANOVA進行分析，各組間的多重比較采用SNK-q檢驗，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

6　結(jié)　果

6.1腦梗死檢測及神經(jīng)功能評分：腦缺血再灌注24h后，洋川芎內(nèi)酯A處理組大鼠缺血側(cè)腦水腫指數(shù)和梗死體積較CTL組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），ASE-H組的效果優(yōu)于ASE-L組，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；洋川芎內(nèi)酯A處理組大鼠的神經(jīng)功能評分較CTL組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1　各組的腦梗死檢測和神經(jīng)功能評分情況

6.2 ELISA檢測結(jié)果：腦缺血再灌注24h后，CTL組大鼠的MDA、IL-1β、IL-6水平較SHAM組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），洋川芎內(nèi)酯A處理組較CTL組顯著降低（P＜0.05），ASE-H組的效果優(yōu)于ASE-L組（P＜0.05），與SHAM組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CTL組大鼠的SOD活性較SHAM組明顯降低（P＜0.05），洋川芎內(nèi)酯A處理組較CTL組顯著升高（P＜0.05），ASE-H組的效果優(yōu)于ASE-L組（P＜0.05），與SHAM組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表2　各組的ELISA檢測結(jié)果情況

7　討論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[4]，在腦血管病患者中，缺血性腦卒中是最為常見的類型之一。腦卒中后的致殘率可達約80%，對患者的工作和生活造成嚴(yán)重影響，也給患者家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。

隨著對腦缺血再灌注損傷的研究不斷深入，尋找有效治療缺血性腦血管疾病的藥物成為亟待解決的問題。在腦缺血再灌注過程中[5]，多個環(huán)節(jié)包括自由基損傷、氧化應(yīng)激損傷、氧化劑過剩以及抗氧化劑不足等相互作用，均可能導(dǎo)致腦組織的防御系統(tǒng)失衡而產(chǎn)生損傷。洋川芎內(nèi)酯A是傘形科植物川芎、當(dāng)歸等中重要的內(nèi)酯類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，洋川芎內(nèi)酯類化合物具有抗氧化損傷、抗炎、抗血小板聚集以及舒張血管等功效[6]。

在本文中，我們研究了洋川芎內(nèi)酯A對于大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及可能的機制。結(jié)果顯示，于術(shù)前7d采用洋川芎內(nèi)酯A預(yù)處理，可明顯減輕MCAO模型大鼠的腦梗死體積、腦水腫指數(shù)和神經(jīng)功能評分，改善MDA、SOD以及IL-1β和IL-6等因子的水平。其中，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可間接反映機體的氧自由基水平，而SOD為細胞內(nèi)外最重要的氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化調(diào)節(jié)的重要抗氧化酶，其活性的高低可反映組織對氧自由基的清除能力。本研究的結(jié)果表明，洋川芎內(nèi)酯A預(yù)處理，可有效降低缺血腦組織再灌注的氧自由基水平。腦缺血前期，可促進大量IL-1β和IL-6等前炎性細胞因子釋放，從而引起炎癥的級聯(lián)放大反應(yīng)，進而加劇中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。本研究的結(jié)果顯示，洋川芎內(nèi)酯A預(yù)處理可顯著抑制缺血半影區(qū)組織中的IL-1β和IL-6的表達，表明洋川芎內(nèi)酯A可抑制缺血再灌注后損傷因子的釋放，緩解炎癥反應(yīng)，從而減輕神經(jīng)功能缺損。

總之，圍術(shù)期采用洋川芎內(nèi)酯A可明顯減輕腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制促炎因子釋放，對于局灶性腦缺血引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有明顯保護作用。

參考文獻

[1]鄧志鋒，李明，汪泱，等.缺血預(yù)處理聯(lián)合阿魏酸鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制[J].中華實驗外科雜志，2005，22（1）：95-97.

[2]劉和蘭，李健哲，梁榮壽.川芎嗪對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（10）：1446-1449.

[3]王樹，張力，張丹參，等.大黃酚對腦缺血再灌注小鼠探索功能的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（12）：3011-3013.

[4]王鐘興，黃雄慶，劉衛(wèi)鋒.阿司匹林對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制[J].中華實驗外科雜志，2015，32（2）：349-351.

[5]張麗娟，劉繼勇，姚翀，等.洋川芎內(nèi)酯類化合物藥理作用研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2015，50（13）：1081-1083.

[6]李云波.通腑解毒法調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應(yīng)及神經(jīng)保護機制[J].中國實用醫(yī)藥，2013，8（22）：264-266.

·臨床研究·

Protective effect of senkyunolide A against rats cerebral ischemia-reperfusion injury

Abstract：Objective：To investigate the effect of senkyunolide A（ASE）on cerebral ischemia-reperfusion injury（IRI）in rats and the related mechanism. Methods：40 Sprague - Dawley male rats were randomly divided into 4 groups：sham-operation group（Sham，n=15），model group（CTL，n=15）and and treatment group treated with ASE（ASE-H group and ASE-L group）. Middle cerebral artery was occluded by thread for 90min，followed by reperfusion. The neurological outcomes including edema index，infare size and neurological deficit scores were evaluated 24h after MCAO. The levels of interleukin（IL）-1β，IL-6 and malonaldehyde（MDA），and activity of superoxide dismutase（SOD）in the brain tissue were assessed according to the corresponding kits. Results：As compared with CTL group，ASE significantly reduced the edema index，infarc size and neurological deficit scores，and the reduction of ASE-H group is obviously better than ASE-L group（P＜0.05）. Also，ASE decreased the tissue levels of IL-1β，IL-6，and MDA，and enhanced the activity of SOD compared to CTL group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）. Conclusion ASE can protect against focal brain IRI partly through the mechanism of attenuating oxidative stress and inhibiting the over-expression of pro-inflammatory cytokines.

Key words：Senkyunolide A Cerebral ischemia reperfusion Oxidative stress Inflammatory

中圖分類號：R285

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）04-0114-02