李思源　何祖強（廣州市藥品檢驗所廣州510405）

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HPLC法測定帕司煙肼中間氨基酚的含量△

李思源何祖強（廣州市藥品檢驗所廣州510405）

摘要：目的：建立帕司煙肼中間氨基酚檢查方法，有效控制帕司煙肼產(chǎn)品中間氨基酚含量。方法：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，流動相：甲醇-10%四丁基氫氧化銨溶液-0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉（100∶21∶450∶450），檢測波長280nm。結(jié)果：方法在1.06～3.18μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)r=0.9999（n=5）；加樣回收率為99.7%，RSD=0.7%；儀器精密度高，多次進樣RSD=0.7%（n=6）。結(jié)論：方法專屬性強，分離度好，準確度高，能有效控制帕司煙肼中間氨基酚含量。

關(guān)鍵詞：HPLC帕司煙肼間氨基酚

帕司煙肼是一種人工合成的新型抗結(jié)核藥物，主要成分包括異煙肼（INH）和對氨基水楊酸（PAS），PAS通過延緩INH在體內(nèi)的乙?；^程，從而延長有效血藥濃度時間，殺菌作用顯著。但隨著臨床應用的推廣，其不良反應越來越受到臨床關(guān)注。帕司煙肼中所含間氨基酚對呼吸、中樞神經(jīng)、消化及內(nèi)分泌系統(tǒng)均有不同程度的毒性作用，長期服用可能導致肝腎功能衰竭、內(nèi)分泌紊亂等嚴重后果。本次研究為國家標準提高任務，通過研究樣品中間氨基酚含量，在原標準的基礎上增訂該檢查項，采用HPLC法測定帕司煙肼中間氨基酚的含量。

1　儀器與試藥

美國Waters 1525型高效液相色譜儀，包括泵、紫外檢測器、自動進樣器，柱溫箱等；瑞士梅特勒托利多XS205DU型電子天平；瑞士梅特勒托利多MT-5型電子天平；Millipore純水儀。

帕司煙肼9批（來源：廣州白云山化學制藥廠，批號：101111001、101111002、101111003；來源：貴州神奇制藥有限公司，批號：110109、110110、110111；來源：重慶華邦凱勝制藥有限公司，批號：PAS-20081001、PAS-20090501、PAS-20090901）；帕司煙肼對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100438-200401）；間氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101160-201001）。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

供試品溶液的配制：取本品，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1mL中含1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）。

系統(tǒng)適用性溶液配置：取帕司煙肼對照品和間氨基酚對照品適量，加流動相配制成每1mL中約含帕司煙肼1mg和間氨基酚1.8μg的混合溶液。

對照品溶液配制：取間氨基酚對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中含1.8μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2色譜條件：色譜柱：Ultimata XB-C18（5um，25cm×4.6mm，）；流動相：甲醇-10%四丁基氫氧化銨溶液-0.05mol/L磷酸氫二鈉-0.05mol/L磷酸二氫鈉（100∶21∶450∶450）；流速：1mL/min；檢測波長：280nm；進樣量：20μL。

2.3系統(tǒng)適應性試驗：在上述色譜條件下，取20μL，注入液相色譜儀，理論板數(shù)按間氨基酚峰計算不低于5000，異煙肼峰、間氨基酚峰和對氨基水楊酸峰的分離度均不小于1.5。

2.4色譜柱耐用性試驗：取系統(tǒng)適用性溶液注入液相色譜儀，以間氨基酚峰理論塔板數(shù)，異煙肼峰、間氨基酚峰和對氨基水楊酸峰分離度為指標，比較4個牌號的色譜柱。結(jié)果4條色譜柱的系統(tǒng)適用性試驗指標均符合要求（詳見表1），供試品及對照品溶液圖譜均可較好滿足檢驗需要，故該法色譜柱耐用性良好。

表1　不同色譜柱系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

2.5線性關(guān)系試驗：精密稱取間氨基酚對照品適量，用流動相稀釋成濃度為1.06～3.18μg/mL的5個溶液，按上述色譜條件測定峰面積，繪制標準曲線圖，計算回歸方程為：y=17579x-1402.6，r=0.9999（n=5）。

2.6回收試驗：取樣品適量，以間氨基酚對照品溶液作為流動相，配制含帕司煙肼濃度為1mg/mL的溶液6份，作為回收試驗溶液。按上述色譜條件分別測定峰面積，以外標法計算各試驗溶液間氨基酚含量，計算平均回收率為99.7%，RSD=0.7%。

2.7定量限試驗：取間氨基酚對照品適量，用流動相稀釋制成濃度為0.35279μg/mL的溶液，作為定量限試驗溶液。照上述色譜條件測定峰面積，按信噪比10∶1換算定量限為0.135μg/mL。

2.8精密度試驗：取間氨基酚對照品溶液，照上述色譜條件連進6針，記錄間氨基酚峰面積，峰面積RSD=0.6%。

2.9供試品溶液穩(wěn)定性試驗：取101111003、110111、PAS-20090901批供試品溶液在0、2、4、6、12h注入液相色譜儀，測定間氨基酚峰面積。結(jié)果三批樣品均隨著時間的延長，峰面積逐漸增大。因此，規(guī)定供試品溶液臨用新制。

2.10測定樣品：按“2.1”配制溶液，照上述方法測定，按外標法計算間氨基酚含量。結(jié)果見表2，典型圖譜見圖1。

表2　間氨基酚檢查結(jié)果（%）

3　討論

3.1檢測波長的選擇：以流動相為溶劑配制19μg/mL的間氨基酚對照品溶液，并進行紫外掃描，結(jié)果間氨基酚最大吸收波長為280nm，故選擇280nm為檢測波長。此波長下檢測靈敏度高，可準確地測定間氨基酚含量。

3.2方法優(yōu)越性：帕司煙肼現(xiàn)行標準為國家藥品標準（試行）WS-10001-（HD-1289）-2002，各國藥典均沒有收載。原標準并無收載間氨基酚項，鑒于間氨基酚的毒性，本研究通過考察樣品中間氨基酚含量及檢測方法，增訂該項。試驗通過對比多個液相系統(tǒng)，摸索各色譜條件，最終發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)專屬性、分離度、色譜柱耐用性更好。故以此擬定方法，并經(jīng)方法學驗證，確定方法精密度、準確性、線性等各項指標良好。

3.3將間氨基酚檢查和含量測定方法統(tǒng)一：原標準含量測定采用高氯酸非水溶液滴定法，用結(jié)晶紫為指示劑。本次標準起草過程同時比較了碘量法（參照進口藥品注冊標準JX20000377帕司煙肼片）和高效液相色譜法。高效液相色譜法色譜系統(tǒng)與擬定間氨基酚檢查項一致，使用對氨基水楊酸鈉對照品和異煙肼對照品作為對照品，用外標法計算異煙肼和對氨基水楊酸相當于理論含量的百分含量（帕司煙肼中異煙肼和對氨基水楊酸理論百分含量分別為47.2%和52.8%），9批樣品比較結(jié)果見表3。結(jié)果，異煙肼和對氨基水楊酸的分子比例為1∶1，碘量法的結(jié)果偏低。由結(jié)果可知，高效液相色譜法專屬性更強，準確性更高；與間氨基酚檢查項方法統(tǒng)一，操作更方便。

表3　含量測定方法結(jié)果比較

參考文獻

[1]段玲，陳章，肖貞良，等.不同類別氟喹諾酮類藥物對老年耐多藥肺結(jié)核的療效評價[J].西南國防醫(yī)藥，2015，25（5）:484-487.

[2]李春盈，何宇芬，盧俊鋼，等.HPLC法測定對氨基水楊酸鈉中有關(guān)物質(zhì)的含量[J].廣東藥學院學報，2013，29（2）:155-158.

[3]馬玉貞，王維劍.依酚氯銨注射液中有關(guān)物質(zhì)的HPLC法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45（9）:871-873.

[4]張哲峰，魏農(nóng)農(nóng)，魯爽，等.淺談雜質(zhì)限度制定的一般原則[J].中國新藥雜志，2008，17（16）:1457-1460.

[5]鄧梅，黃潔，單敏，等.反相高效液相色譜法測定對氨基水楊酸鈉片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥業(yè)，2012，21（19）:41-42.

[6]郭貴芳，曹艷玲，韋群，等.注射用對氨基水楊酸鈉的細菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥師，2007，10（12）:1225-1226.

[7]邱涵，葉飛云，陳素儉，等.氣相色譜法測定帕司煙肼片中帕司煙肼的含量[J].中國藥學雜志，2006，41（7）:556-557.

Determination of content of m-aminophenol in pasiniazide by HPLC

Li Siyuan He Zuqiang（Guangzhou Institute For Drug Control）

Abstract：Objective：To establish the examination method of m-aminophenol in pasiniazide and to effectively control the content of maminophenol in pasiniazide products. Methods：The determination was performed on C18 column with methanol -10% of tetrabutylammonium hydroxide ammonium solution -0.05mol/L disodium hydrogen phosphate-0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate （100∶21∶450∶450 V/V/V/V）as mobile phase. The detection wavelength was set at 280nm. Results：When the method was in the range of 1.06～3.18μg/ml，the linear relation is good and the correlation coefficient was r=0.9999（n=5）; The sample recovery rate was 99.7%，RSD=0.7%; The instrument was with high precision and multiple injection RSD=0.7%（n=6）. Conclusion：The method is specific，with good separation and high accuracy. It can effectively control the content of m-aminophenol in pasiniazide.

Key words:HPLC Pasiniazide M-aminephenol

基金項目△名稱：磷酸伯安喹全球基金項目（全球基金國家藥品標準提高課題），編號：GF2012-38

中圖分類號：R927.2

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8351（2016）04-0007-02