計(jì)燕萍唐　嵐（.嘉興學(xué)院　嘉興　3400；2.浙江工業(yè)大學(xué)　杭州　3004）

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分光光度法測定紅樹秋茄中總黃酮含量

計(jì)燕萍1唐嵐2*（1.嘉興學(xué)院嘉興314001；2.浙江工業(yè)大學(xué)杭州310014）

摘要：目的：建立紅樹秋茄中總黃酮含量的測定方法。方法：采用紫外分光光度法，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選顯色方法和顯色條件，建立總黃酮含量的測定方法。結(jié)果：采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法，以蘆丁作為對照品，在0.02～0.1mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2=0.9999，平均回收率為103.02%（RSD=2.2%.n=8）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于秋茄總黃酮含量的測定。

關(guān)鍵詞：秋茄總黃酮紫外分光光度法含量測定

紅樹林（Mangrove plants）是熱帶和亞熱帶海岸一種特有的植被，為耐鹽、常綠喬木或灌木。秋茄（Kandelia candel）為紅樹科秋茄屬植物，本屬只有一種，即為秋茄，為紅樹植物分類中的真紅樹植物[1]。秋茄一直有民間藥用歷史，秋茄樹皮具有收斂止血、生肌斂瘡的功效，主治外傷出血、水火燙傷。根可祛風(fēng)除濕主治慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]?，F(xiàn)有研究表明秋茄中的化學(xué)成分主要有黃酮類、鞣質(zhì)類、甾醇類、脂肪酸和多糖等[3]。藥理研究發(fā)現(xiàn)秋茄具有抑菌、抗腫瘤、抗胃潰瘍[4～6]等作用，但其含量測定的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法，建立紅樹秋茄總黃酮含量的測定方法，為秋茄的質(zhì)量控制提供參考。

1　儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)與儀器：蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院）；大孔樹脂AB-8（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、95%乙醇為分析純，純化水為自制。紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津RF-540型）；電子分析天平（北京賽多利斯BS224S型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHIR210型）。

1.2藥材來源與鑒定：秋茄采自浙江省樂清市西門島南岙村濱海濕地，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)張永紅教授鑒定為紅樹科植物秋茄（Kandelia candel）。

藥材前處理：將秋茄葉洗凈瀝干剪碎，置37℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎機(jī)粉碎，過二號篩，得秋茄葉粗粉放置干燥器中備用。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10mg，加入適量60%乙醇加熱溶解后定容于50mL容量瓶中，搖勻備用。

2.2供試品溶液的制備：樣品的制備：精密稱取100g秋茄粗粉于圓底燒瓶中，80℃水浴加熱，60%乙醇回流提取3次，每次1h。提取液抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，離心得上清液。將上清液過大孔樹脂AB-8，60%乙醇洗脫。收集洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至稠浸膏，冷凍干燥至粉末，在干燥器中保存。

供試品溶液的配制：取適量秋茄總黃酮粉末，60%乙醇溶解定容，搖勻備用。

2.3測定波長的確定：精密量取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各1.0mL，分別加入5%NaNO2溶液0.6mL，搖勻，放置6min。再加入10% Al（NO3）3溶液0.6mL，搖勻，放置6min。加入1mol/ LNaOH溶液6mL，60%乙醇定容，搖勻。以60%乙醇作為參比溶液，在300～700nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對照品與樣品溶液在500nm處均有最大吸收峰。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別精密吸取蘆丁對照品液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按照“2.3”的測定方法，以60%乙醇作為參比溶液，于波長500nm處測定吸光度，平行兩組，取平均值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁對照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程Y=12.6411X-0.0029（r2=0.9999）。

2.5顯色條件考察

2.5.1乙醇濃度對吸光度值的影響：精確吸取1.0mL蘆丁對照溶液和提取液，分別用純水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇稀釋定容，測定吸光度，平行三組，取平均值，結(jié)果見表1，60%乙醇對秋茄黃酮的溶解性較好，對吸光度值的影響小，故采用60%乙醇作為稀釋劑，較為合理。

表1　乙醇濃度對吸光度的影響結(jié)果

2.5.2顯色劑加入時(shí)間、顯色時(shí)間對吸光度值的影響：精確吸取1.0mL蘆丁對照溶液和提取液，用60%乙醇稀釋定容，每次只改變一個(gè)時(shí)間因素，其余按上述方法測定吸光度值，平行三組，取平均值，結(jié)果見表2。表2表明，加入5%NaNO2溶液后的放置時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，考慮到機(jī)器以及人為誤差的影響，可以認(rèn)為加入NaNO2溶液后放置6min沒有必要，所以在后續(xù)試驗(yàn)中加入NaNO2溶液搖勻后立即加入Al（NO3）3溶液。

加入Al（NO3）3溶液后的放置時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響，從機(jī)理上分析可能是鋁離子和黃酮化合物形成絡(luò)合物需要一定的時(shí)間才能達(dá)到穩(wěn)定。結(jié)果表明，放置6min后的含量測定最高，故選擇加入Al（NO3）3溶液6min后再加入NaOH溶液。

加入NaOH溶液的10min內(nèi)，含量測定結(jié)果基本一致，表明在此期間顯色后的物質(zhì)穩(wěn)定。

表2　顯色劑加入時(shí)間、顯色時(shí)間對吸光度的影響結(jié)果

綜上所述，優(yōu)化后的含量測定方法為：用60%乙醇稀釋和定容樣品。樣品溶液加入0.6mL 5%NaNO2溶液，搖勻后立即加入0.6mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6min，加入6mL 1mol/ LNaOH溶液后立即在波長500nm處測定吸光度。該方法耗時(shí)少，不影響含量測定結(jié)果。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取樣品提取液1mL，按“2.5”方法顯色，每隔10min測定1次吸光度值，連續(xù)1h，考察顯色的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3，表明供試品液在30min內(nèi)穩(wěn)定。

表3　穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.7精密度試驗(yàn)：精密吸取同一樣品提取液1mL，分別置于5個(gè)10mL容量瓶中，按“2.5”顯色方法測定吸光度，平行三組，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），結(jié)果見表4，RSD為0.65%。

表4　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)：按照“2.2”制備相同樣品液3份，精密吸取1mL，按“2.5”顯色方法測定吸光度，平行三組，計(jì)算總黃酮含量及RSD。結(jié)果見表5，表明秋茄提取液中平均總黃酮濃度為44.97μg/mL，RSD為1.42%，表明供試品的重現(xiàn)性良好。

表5　重現(xiàn)性考察結(jié)果

2.9加樣回收率試驗(yàn)：分別精密吸取已知含量的提取液1.0mL，分別精密加入配制的蘆丁對照溶液0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL；準(zhǔn)確吸取提取液0.5mL于10mL容量瓶中，分別加入蘆丁對照溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL。按2.5方法測定加入后的吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），結(jié)果見表6，回收率平均值為103.02%，RSD為2.2%（n=8），說明該方法測定秋茄總黃酮的含量結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確。

表6　回收率考察結(jié)果

3　討論

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，建立了亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉體系測定秋茄中總黃酮含量的方法，并優(yōu)化了該顯色方法。方法學(xué)考察顯示該法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，為進(jìn)一步研究秋茄總黃酮提供理論及數(shù)據(jù)支持。

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Spectrophotometric Determination of Total Flavonoids in Kandelia candel

Ji Yanping1Tang Lan2*（1.Jiaxing University，Jiaxing 314000，China; 2.Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Abstract：Objective：To establish a method for determination of the content of total flavonoids in Kandelia candel．Method：single factor tests were adopted to optimize colorimetry methods and conditions by UV FDS，determination of the content of total flavonoids was established．Result：Selecting rutin as a reference substance，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method was adopted，rutin had a liner relationship with absorbance in the range of 0.02～0.1mg/mL，r2=0.9999，average recovery was 103.02% with RDS of 2.2%，n =8. Conclusion：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH method appeared to be an accurate，reliable and repeatable system fordetermination of total flavonoids in Kandelia candel．

Key words：Kandelia candel Total flavonoids Ultraviolet spectrophotometry Determination

*通訊作者

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8351（2016）04-0005-02