馮思航，馮登殿

大鼠脛神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端髓鞘和軸索再生的研究

馮思航1，馮登殿2

目的：探討大鼠脛神經(jīng)損傷時(shí)遠(yuǎn)側(cè)端髓鞘和軸突的再生速度。方法：大鼠54只，建立神經(jīng)原位橋接動物模型，其中36只大鼠用于熒光示蹤注射，根據(jù)縫合口神經(jīng)遠(yuǎn)端熒光示蹤劑注射點(diǎn)位置不同，分為10 mm組和30 mm組各18只，分別于術(shù)后4、8、12周三個時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理，每組每個時(shí)間點(diǎn)6只；其他18只大鼠用于髓鞘染色，分別于術(shù)后4、8、12周三個時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。結(jié)果：術(shù)后8、12周，10 mm和30 mm組的L3～L6脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)有熒光標(biāo)記細(xì)胞，30 mm組明顯少于10 mm組，有顯著性差異（P＜0.01)；術(shù)后8、12周，患側(cè)的損傷神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端有大量排列有序的有髓神經(jīng)纖維，10 mm組與30 mm組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。10 mm和30 mm組術(shù)后8、12周的脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于術(shù)后4周，有顯著性差異（P＜0.01）；術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，患側(cè)的脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均低于正常對照（健側(cè)），有顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)論：大鼠脛神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)端髓鞘和軸索生長速度不一致。

神經(jīng)再生；髓鞘；軸索；神經(jīng)元；大鼠

周圍神經(jīng)損傷中，斷裂和缺損最常見，且修復(fù)效果不佳。如何修復(fù)神經(jīng)損傷、促進(jìn)損傷神經(jīng)盡快再生，成為目前基礎(chǔ)和臨床神經(jīng)外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]。周圍神經(jīng)損傷后失神經(jīng)支配的肌肉在傷后第2周即可出現(xiàn)一些生化方面的改變，數(shù)周內(nèi)肌纖維出現(xiàn)萎縮，一些小肌肉萎縮得更快，并出現(xiàn)纖維化，6周后運(yùn)動終板將逐漸發(fā)生退變乃至消失[2]，皮膚感覺減退，這將直接影響傷后神經(jīng)修復(fù)，對于神經(jīng)再生也增加了難度，成為后期器官功能恢復(fù)不良的原因之一，即所謂失神經(jīng)骨骼肌不可逆萎縮。

近20年來，人們進(jìn)行許多修復(fù)神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究，采用許多術(shù)式，如端端吻合、端側(cè)吻合、“π”式橋接、導(dǎo)管橋接、自體、異體移植、非神經(jīng)組織移植、雪旺式細(xì)胞種植、干細(xì)胞種植修復(fù)缺損及促神經(jīng)生長用藥。在顯微外科最多見是端端縫合，除損傷神經(jīng)再生纖維數(shù)量有限外，單純的外科操作也難以做到相應(yīng)神經(jīng)功能束正確對接，可導(dǎo)致再生神經(jīng)錯向生長，這又可以是造成器官功能恢復(fù)不良或困難的又一因素。目前診斷和評價(jià)周圍神經(jīng)損傷和再生程度的方法有多種，最常用的是電生理檢測，神經(jīng)再生的電生理評價(jià)結(jié)果與臨床神經(jīng)功能恢復(fù)存在較大差異[3]。為了觀察電生理診斷神經(jīng)損傷和評價(jià)神經(jīng)再生與實(shí)際神經(jīng)功能恢復(fù)不相符的原因，進(jìn)一步揭示失神經(jīng)肌萎縮的本質(zhì)，本研究采用原位橋接術(shù)式制備動物模型，應(yīng)用肌電檢測手段、神經(jīng)追蹤、神經(jīng)髓鞘染色方法[4]，結(jié)合多點(diǎn)定位檢測（未見報(bào)道），分別觀察神經(jīng)纖維中的髓鞘、神經(jīng)纖維中的軸索的再生數(shù)量、質(zhì)量，分析髓鞘和軸索再生速度是否同步一致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 Wistar大鼠54只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～220 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)動物中心，制備神經(jīng)原位橋接動物模型。其中36只大鼠用于熒光示蹤注射，根據(jù)縫合口神經(jīng)遠(yuǎn)端熒光示蹤劑注射點(diǎn)位置不同，分為10 mm組和30 mm組各18只，分別于術(shù)后4、8、12周三個時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理，每組每個時(shí)間點(diǎn)6只；其他18只大鼠用于髓鞘染色，分別于術(shù)后4、8、12周三個時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。

1.1.2 主要試劑與儀器 熒光示蹤劑（true blue，TB，購于美國Sigma-Aldich公司）；髓鞘染色劑Luxol快藍(lán)MBS（由上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝）；4000型肌電圖檢測儀（購于丹麥丹迪公司）；HMIAS-2000型圖像分析儀（購于武漢千屏公司）；Axioskop 2 plus熒光顯微鏡（購于德國Zeiss公司）；SXP-LB手術(shù)顯微鏡（購于上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；CM1900恒冷箱切片機(jī)（購于德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 神經(jīng)原位橋接動物模型制備：將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）行腹腔注射麻醉，在無菌條件下行右臀斜切暴露出右側(cè)坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣5 mm處在放大10倍的手術(shù)顯微鏡下分離脛、腓總神經(jīng)，切取脛神經(jīng)長約8 mm，造成缺損，然后原位用10-0可吸收顯微外科縫線行外膜縫合，兩斷端分別均勻縫合3針，盡量保持神經(jīng)外膜完整，對位準(zhǔn)確，不扭曲成角，傷處內(nèi)置長效青霉素粉劑，最后用1-0絲線依次縫合肌肉皮膚。對照組在麻醉后同樣暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，但不切斷神經(jīng)，術(shù)后分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 檢測項(xiàng)目 ①熒光劑示蹤：10 mm、30 mm組分別于術(shù)后4、8、12周用微量注射器將0.2%10 μL熒光示蹤劑緩慢注入神經(jīng)縫合口遠(yuǎn)端10 mm處或遠(yuǎn)端30 mm處脛神經(jīng)干內(nèi)，注射點(diǎn)外墊塑料薄膜留針15 min，注射后用凡士林封閉72 h后處死。②電生理檢測：18只用于髓鞘染色的大鼠，分別于術(shù)后4、8、12周用刺激信號強(qiáng)度為0.9 mA、波寬0.1 ms方波的肌電圖檢測儀，測量脛神經(jīng)的運(yùn)動傳導(dǎo)速度，以健側(cè)為正常對照。在切取標(biāo)本前先游離出實(shí)驗(yàn)側(cè)的脛神經(jīng)，然后將刺激電極置于縫合口近端的神經(jīng)干上，在小腿三頭肌處插入記錄電極進(jìn)行測量。③髓鞘染色：18只大鼠于術(shù)后4、8、12周進(jìn)行電生理檢測后，分別在縫合口遠(yuǎn)側(cè)10 mm、30 mm處切取神經(jīng)組織，采用Luxol快藍(lán)MBS髓鞘染色法進(jìn)行染色，脊神經(jīng)節(jié)每例標(biāo)本取5張切片，每組共30張進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 取材 選擇制備成功的動物模型，肉眼觀察足底無明顯潰瘍，小腿三頭肌較飽滿的神經(jīng)組織進(jìn)行取材。處死各組大鼠，0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，生理鹽水經(jīng)心臟主動脈灌注沖洗，4%多聚甲醛0.1 mol/L，磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）灌注固定，后固定2 h，熒光示蹤切取L3～L6脊髓節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)置于20%蔗糖內(nèi)4℃冰箱內(nèi)過夜，再行恒冷箱切片，片厚40 μm，貼于鉻明膠片上，進(jìn)行熒光標(biāo)注的切片直接在鏡下閱片拍照，進(jìn)行髓鞘染色的切片，分別在縫合口遠(yuǎn)側(cè)10 mm、30 mm處切取神經(jīng)組織；進(jìn)行髓鞘染色切片的動物，處死前進(jìn)行電生理檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)熒光示蹤

術(shù)后4周，10 mm、30 mm組的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)有熒光標(biāo)記細(xì)胞，30 mm組少于10 mm組（P＜0.01，圖1A，表1）；術(shù)后8周，10 mm、30 mm組的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)增多，30 mm組的熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于10 mm組（P＜0.01，圖1B、C，表1）；術(shù)后12周，30 mm組的熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)少于10 mm組（P＜0.01），10 mm、30 mm組的熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)均明顯多于術(shù)后8周（圖1D、E，表1）。

表1 2組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊神經(jīng)節(jié)熒光標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)（個，）

表1 2組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)脊神經(jīng)節(jié)熒光標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)（個，）

注：與10 mm組比較，①P＜0.01；與術(shù)后4周比較，②P＜0.01；與術(shù)后8周比較，③P＜0.01

組別 只數(shù) 術(shù)后4周 術(shù)后8周 術(shù)后1 2周1 0 m m組 6 1 2 . 6 ± 1 . 3 5 1 6 . 8 ± 1 . 1 6①② 3 2 . 3 ± 1 . 3 2①②③3 0 m m組 6 4 . 6 ± 0 . 8 6① 7 . 1 ± 1 . 0 6①② 1 5 . 0 ± 2 . 0 5①②③

2.2 髓鞘染色

術(shù)后4周，10 mm組可見少量深染和較多的淡染有髓神經(jīng)纖維（圖2A），30 mm組縫合口遠(yuǎn)端各點(diǎn)組織像呈現(xiàn)部分深染，部分髓鞘明顯淡染（圖2B）；術(shù)后8、12周，30 mm組遠(yuǎn)端各段吻合口以遠(yuǎn)的髓鞘染色加深，髓鞘輪廓較清晰，排列較整齊，單位面積內(nèi)有髓神經(jīng)纖維數(shù)減少不明顯，部分髓鞘呈塌陷狀或變形現(xiàn)象，神經(jīng)外膜、束膜、內(nèi)膜完整清晰可辨（圖2C、D）。術(shù)后8、12周，30 mm組的神經(jīng)纖維數(shù)多于術(shù)后4周，有顯著性差異（P＜0.01）；術(shù)后12周，10 mm組和30 mm組的神經(jīng)纖維數(shù)與術(shù)后8周比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后8、12周，10 mm、30 mm組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)10 mm、30 mm組熒光標(biāo)記細(xì)胞（熒光神經(jīng)示蹤，×400）

表2 各組有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)（）

表2 各組有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)（）

注：與術(shù)后4周比較，①P＜0.01

組別 只數(shù) 術(shù)后4周 術(shù)后8周 術(shù)后1 2周1 0 m m組 6 1 2 0 9 . 8 ± 4 8 . 8 1 8 0 5 . 3 ± 2 3 . 2① 1 8 6 0 . 1 ± 7 4 . 8①3 0 m m組 6 9 0 7 . 8 ± 4 7 . 5 1 7 0 6 . 1 ± 7 4 . 8① 1 7 8 0 . 5 ± 8 0 . 6①

2.3 神經(jīng)電生理檢測

患側(cè)術(shù)后8、12周的脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于術(shù)后4周，有顯著性差異（P＜0.01），術(shù)后8周和12周之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，患側(cè)的脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均低于正常對照（健側(cè)），有顯著性差異（P＜0.01），見表3。

表3 脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s，）

表3 脛神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（m/s，）

注：與正常對照比較，①P＜0.01；與術(shù)后4周比較，②P＜0.01

組別 只數(shù) 4周 8周 1 2周正常對照 6 4 8 . 1 6 ± 4 . 0 1 4 9 . 3 3 ± 3 . 4 7 5 0 . 3 8 ± 3 . 8 9患側(cè) 6 1 3 . 6 1 ± 4 . 1 2① 4 0 . 1 4 ± 4 . 0 4①② 4 3 . 5 ± 3 . 7 2①②

3 討論

3.1 遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)損傷后髓鞘軸索再生過程

神經(jīng)損傷，尤其中樞神經(jīng)損傷難以再生，但外周神經(jīng)損傷是可以再生的，這主要與施萬細(xì)胞的作用有關(guān)[5,6]。神經(jīng)損傷后，其遠(yuǎn)側(cè)段神經(jīng)會發(fā)生一系列特異性改變，即Wallerian變性[7,8]，原有神經(jīng)纖維崩解，同時(shí)處于靜態(tài)的施萬細(xì)胞即進(jìn)入增殖相開始分裂，分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)及黏附因子，并誘導(dǎo)和參與巨噬細(xì)胞進(jìn)入損傷處，協(xié)助施萬細(xì)胞進(jìn)入損傷的神經(jīng)處，幫助施萬細(xì)胞吞噬、清除髓鞘及軸突潰變的殘余物和碎屑，同時(shí)有活性的施萬細(xì)胞促進(jìn)基底膜形成連續(xù)的Schwann管，為軸突再生提供支持通道，引導(dǎo)其生長方向做前期準(zhǔn)備[9,10]，此時(shí)的近段軸突由斷端處向后退縮，軸膜在斷端處生長并封蓋斷端，從而阻止軸漿外流，并在近斷端處軸突明顯形成膨大的回縮球，其內(nèi)堆雜著各種細(xì)胞器、神經(jīng)絲、囊泡和線粒體等，在回縮球表面長出大量的軸突枝芽，實(shí)現(xiàn)終末神經(jīng)再生并沿著Schwann管向神經(jīng)的遠(yuǎn)端段生長。

本研究顯示，損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)端神經(jīng)外膜、束膜、內(nèi)膜和基膜輪廓仍保持完整，術(shù)后4周，在縫合口遠(yuǎn)段神經(jīng)內(nèi)出現(xiàn)許多深染的髓鞘，術(shù)后8、12周，有髓神經(jīng)纖維數(shù)量明顯增多，數(shù)量上無差別，患側(cè)與健側(cè)髓鞘染色相比明顯淡染部分髓鞘在染色過程中容易塌陷變形，提示神經(jīng)髓鞘恢復(fù)較快，但施萬細(xì)胞功能未完全恢復(fù)到正常狀態(tài)，其有髓神經(jīng)纖維數(shù)也未達(dá)到健側(cè)水平。在神經(jīng)移植后的修復(fù)過程中，只有施萬細(xì)胞從近端游走并進(jìn)入移植神經(jīng)節(jié)段，軸索才能通過移植段進(jìn)行再生。因此，施萬細(xì)胞分裂和髓鞘形成在軸索的再生過程中起著關(guān)鍵、不可代替的作用[11]，但有髓纖維數(shù)量和質(zhì)量完全恢復(fù)到正常水平可能是很困難的。

圖2 術(shù)后2組各時(shí)間點(diǎn)髓鞘觀察（Luxol快藍(lán)MBS髓鞘染色）

3.2 再生神經(jīng)電生理改變和軸漿流轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)系

神經(jīng)突觸傳遞分為化學(xué)性傳遞和電傳遞兩類，前者的信息傳遞媒介物是神經(jīng)遞質(zhì)，而后者的信息傳遞媒介物為局部電流，化學(xué)傳遞是通過神經(jīng)纖維內(nèi)軸索的軸漿流途徑完成，而電傳遞則是通過神經(jīng)纖維的髓鞘，從一個朗飛結(jié)向另一個朗飛結(jié)呈跳躍式快速傳導(dǎo)的途徑完成神經(jīng)沖動的傳遞。電傳導(dǎo)可通過電生理檢測，電生理被認(rèn)為是一種靈敏和較準(zhǔn)確的定量方法，也是目前臨床上最常用的診斷傳導(dǎo)功能的手段[12,13]，反映髓鞘電傳導(dǎo)通路的建立及恢復(fù)程度。本研究觀察到電生理指標(biāo)已恢復(fù)到約60%～80%。反映化學(xué)傳遞檢測常用神經(jīng)示蹤方法，本研究采用是熒光示蹤，熒光劑被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)追蹤以研究神經(jīng)通路，熒光能被神經(jīng)末梢和軸索攝取通過軸漿順、逆雙向運(yùn)輸?shù)剿诟杏X、運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞胞體中[14,15]，與神經(jīng)纖維中微管、微絲和各種膜細(xì)胞器等密切相關(guān)，一旦神經(jīng)纖維失去連續(xù)性，熒光劑就無法從遠(yuǎn)端被運(yùn)送到近端神經(jīng)內(nèi)而聚集在細(xì)胞體中。所以神經(jīng)再生的有力證據(jù)，就是軸漿流是否能通過縫合口。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在縫合口遠(yuǎn)端10 mm、30 mm處，分別注射熒光劑，在相應(yīng)的脊髓節(jié)段的脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)，出現(xiàn)一定數(shù)量的強(qiáng)、中、弱陽性細(xì)胞，說明此時(shí)軸索再生已通過縫合口而長入神經(jīng)遠(yuǎn)段內(nèi)，同時(shí)也說明軸索已具有軸漿流的運(yùn)轉(zhuǎn)能力。本研究中還發(fā)現(xiàn)，在縫合口遠(yuǎn)側(cè)30 mm處注射的熒光劑和在10 mm處注射的熒光劑相比較，30 mm處注射部位在脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的標(biāo)記細(xì)胞較少，中、弱陽性細(xì)胞較多，說明部分軸索還沒有長到更遠(yuǎn)段。由于不能對熒光攝取進(jìn)行定量估計(jì)，就無法對神經(jīng)軸漿流的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行較準(zhǔn)確的定量比較。

3.3 電生理與臨床功能評價(jià)的分析

在許多神經(jīng)修復(fù)的研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)再生的電生理評價(jià)結(jié)果與臨床神經(jīng)功能恢復(fù)存在較大差異[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，髓鞘的功能恢復(fù)過程中見髓鞘在神經(jīng)再生早期恢復(fù)相對較快，在8周和12周，10 mm組和30 mm組之間有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在患側(cè)8周與12周之間運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明電生理結(jié)果與神經(jīng)纖維中的髓鞘數(shù)關(guān)系密切，而在神經(jīng)示蹤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中見8周與12周相比，有顯著性差異（P＜0.01），提示示蹤劑轉(zhuǎn)運(yùn)縫合口的量有限或不完全，這說明軸索再生跨越縫合口的數(shù)量有限，而且跨越縫合口的軸索也不能全部抵達(dá)神經(jīng)末梢或者神經(jīng)-肌接頭而建立化學(xué)傳導(dǎo)通路，提示髓鞘與軸索生長速度不一致?？傊庵苌窠?jīng)損傷恢復(fù)是一個復(fù)雜的問題，外周神經(jīng)恢復(fù)質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)評估，尚有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：王晶）

Remyelinatin and Axonal Regeneration of Distal Stumps Following Tibial Nerve Transection in Rats

FENG Si-hang,FENG Deng-dian.1.Department of Dermatology,Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518038,China;2.Department of Central Laboratory,Shenzhen Shajing People's Hospital of Guangzhou Medical University,Shenzhen 518104,China

Objective:To investigate the speed of the regeneration of the medullary sheath and axonsof distal stumps following tibial nerve injury in rats.Methods:An autogenous nerve transplantation model was created in 54 rats,and the fluorescent tracer injection was performed in 36 rats.According to the distance between the injection location and repair site of the distal stumps,the rats were divided into 10 mm group and 30 mm group （18 rats in each group）.The other 18 rats were used formedullary sheath staining.Observation was conducted at postoperative weeks 4,8,and 12.Results:At weeks 8 and 12,fluorescent-labeled-cells in the L3～L6dorsal root ganglia in the group 30 mm were evidently fewer than those in the group 10 mm(P＜0.01).At weeks 8 and 12,both the 10 mm and 30 mm groups showed a large number of well-ordered myelinated nerve fibers at the distal stumpof the injured nerves.There was no significant statistic difference between the two groups(P＞0.05).The conduction velocity of the tibial motor nerve at weeks 8 and 12 was faster than that at week 4 in the group 10 mm and 30 mm(P＜0.01). The conduction velocity of the tibial motor nerve in the experimental groups was lower than that of the normal control at every postoperative points(P＜0.01).Conclusion:The regeneration rates of the medullary sheath and axon in distal stumps were different following tibial nerve transaction in rats.

nerve regeneration;medullary sheath;axon;neuron;rats

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.02.003

1.深圳市兒童醫(yī)院皮膚科深圳518026

2.廣州醫(yī)科大學(xué)深圳沙井人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室深圳518104

2015-06-24

馮思航1.31@163.com