宋富成

【摘要】目的：探索最適宜的教學(xué)菌種的保存方法。方法：采用六種方法將細(xì)菌保存一年，復(fù)蘇后比較各保存方法后菌種的存活率和生化指標(biāo)等。結(jié)果：用脫脂牛奶冷凍干燥保存法、脫脂奶粉冷凍干燥保存法保存菌種1年后存活率高達(dá)100%，且菌種的形態(tài)和生物學(xué)特性未改變。濾紙片低溫冷凍保存法、甘油原液低溫冷凍保存法保存菌種1年后菌種存活率為94.62%，保存液低溫冷凍保存法保存菌種1年后存活率在99% 以上，半固體低溫冷凍保存法保存菌種1年后存活率僅為66.54%。結(jié)論：脫脂牛奶冷凍干燥保存法、脫脂奶粉冷凍干燥保存法較其他保存菌種方法時(shí)間長(zhǎng)，可用于各菌種保存，穩(wěn)定性好，存活率高，適用于有條件的實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)期保存菌種。

【關(guān)鍵詞】菌種保存；保存方法；比較

菌種作為一項(xiàng)重要的生物資源，是醫(yī)學(xué)微生物教學(xué)和研究的重要工作，同時(shí)與臨床疑難菌株的鑒別分離有著密切聯(lián)系。菌種保存方法因菌種而已，適宜的保存方法不僅可以保證細(xì)菌的存活，而且能保證細(xì)菌在形態(tài)、毒性及生化指標(biāo)的穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)在比較各菌種保存方法優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上，探索合適的菌種保存方法，選擇簡(jiǎn)單易操作，對(duì)設(shè)備要求低的菌種保存方法以用于微生物的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌種： 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、傷寒沙門菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、乙型副溶血性鏈球菌、變形桿菌等。（2） 培養(yǎng)基： 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、半固體、血瓊脂培養(yǎng)基。（3）1.5ml EP管，2ml凍存管。（4）標(biāo)簽紙，封口膠布。（5）真空冷凍干燥機(jī)，-70℃ 冰箱。

1.2 保存方法

濾紙片保存法[1]：打孔器制取d=3mm圓形濾紙片，10ml普通試管加塞高壓消毒滅菌備用，用滅菌鑷子夾取濾紙片于平板上正反面蘸取待保存菌種的純菌落1-2個(gè)。放于高壓消毒滅菌后的1.5ml EP管再用封口膠帶將蓋邊緣封好于-70℃冰箱保存。

甘油原液保存法：將純化后的待保存菌種，用高壓消毒滅菌后的濾紙片正反面蘸取1-2個(gè)菌落，置于1.5ml EP管中，滴加0.3ml甘油原液，膠帶將蓋邊緣封好于-70℃冰箱保存。

菌種保存液法：配制：K2HPO4?：12.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4·7H2O：0.18g，KH2PO4： 3.6g，甘油88g加蒸餾水至1000ml，121℃滅菌30分鐘，4℃保存?zhèn)溆肹2]。將細(xì)菌接種于普通瓊脂平板或血平板，37℃培養(yǎng)24h后，加入3ml備用的菌種保存液，刮取菌落，洗下菌苔充分混勻。微量加樣器取0.5ml菌液分裝于2ml凍存管中，將蓋擰緊于-70℃冰箱保存。

半固體保存法：將普通瓊脂高壓消毒滅菌后，無菌環(huán)境下取1ml分裝2ml凍存管中，加蓋備用。將待保存的菌種平板劃線分離后，用接種針取單個(gè)菌落穿刺接種到備用的半固體培養(yǎng)基中，加蓋擰緊在37℃ 下培養(yǎng)24h后，存放于-70℃冰箱保存。

脫脂牛奶冷凍干燥法[3]：鮮牛奶煮沸，冷卻脫脂，8磅15min滅菌備用。取3ml脫脂牛奶加入待保存菌種平板內(nèi)，用取菌環(huán)刮取菌落，輕輕磨勻。以微量加樣器量取0.3ml脫脂牛奶菌懸液加入2ml凍存管，加蓋擰緊4℃冰箱保存20min，再轉(zhuǎn)到-20℃冰箱速凍30min.取出后，將蓋稍擰松放于真空冷凍干燥機(jī)中，真空干燥24h。冷凍干燥結(jié)束后，將蓋擰緊，于-70℃冰箱保存。

脫脂奶粉冷凍干燥法：配備15%奶粉乳液，煮沸冷卻脫脂，8磅15min滅菌備用。取3ml脫脂奶粉乳液加入待保存菌種平板內(nèi)，用取菌環(huán)刮取菌落，輕輕磨勻。以微量加樣器量取0.3ml菌懸液加入2ml凍存管，加蓋擰緊4℃冰箱保存20min， 再轉(zhuǎn)到-20℃冰箱速凍30min。取出后，將蓋稍擰松放于真空冷凍干燥機(jī)中，真空干燥24h。冷凍干燥結(jié)束后，將蓋擰緊，于-70℃冰箱保存。

1.3 活力檢測(cè)方法 分別于保藏后3、6、9、12個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇。從-70℃取出一套保存的菌種，37℃水浴快速解凍，根據(jù)菌種不同特性，選擇不同培養(yǎng)基復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)菌的存活情況，計(jì)算存活率[4]。并結(jié)合教學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌的形態(tài)、染色特性觀察、生化反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)和毒力的檢測(cè)等，比較各教學(xué)菌種生物特性是否發(fā)生變化。

存活率=（菌株存活數(shù)/受檢菌株數(shù)）×100%

2結(jié)果

6種方法保存1年后存活數(shù)量及存活率見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組在存活率存在差異。脫脂牛奶冷凍干燥法和脫脂牛奶冷凍干燥法保存效果最好，復(fù)蘇后全部存活，在細(xì)菌的形態(tài)、染色特性觀察、生化反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)和毒力的檢測(cè)方面未發(fā)生改變。保存液法也能起到較好的保存作用，在短期保存效果上與以上兩種方法相同。濾紙片法和甘油原液法在存活率及各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)并無差異。半固體法一年內(nèi)存活效果最差，復(fù)蘇后細(xì)菌形態(tài)發(fā)生改變，部分生化指標(biāo)異常。

3討論

菌種保存是醫(yī)學(xué)微生物教學(xué)必不可少的工作，菌種保存的目的不僅是保持菌種的活性，還要維持各菌種的典型生物學(xué)特性、形態(tài)，盡可能的不發(fā)生或少發(fā)生變異。

本實(shí)驗(yàn)表明濾紙片低溫冷凍法保存菌種，操作方便、所需材料簡(jiǎn)單、菌種復(fù)蘇便捷，保存時(shí)間長(zhǎng)，也可避免因反復(fù)傳代而造成的菌種生物學(xué)特性的改變，適用于一般醫(yī)學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存營(yíng)養(yǎng)要求條件不高的菌種。保存液低溫冷凍保存法制作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，且不需要經(jīng)常接種，可保存數(shù)年，但要注意保存的時(shí)候需直立存放。甘油原液低溫冷凍法，細(xì)菌在低溫高滲下代謝率低，甘油的保護(hù)緩沖作用有利于細(xì)菌的穩(wěn)定性，不易發(fā)生變異，保持個(gè)菌種的生物學(xué)特性，而且操作簡(jiǎn)單，保存時(shí)間較長(zhǎng)。半固體瓊脂低溫冷凍法，該方法簡(jiǎn)單易操作，技術(shù)要求不高，且復(fù)蘇簡(jiǎn)單，但該方法適用于抵抗力較強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求不高的菌種保存，保存時(shí)間較短，需反復(fù)傳代接種保存，易造成菌種變異，適用實(shí)驗(yàn)室短期保存。真空冷凍干燥低溫保存法保存時(shí)間長(zhǎng)，生物學(xué)特性不易發(fā)生變性，牛奶和奶粉保存菌種無材料差異，但操作過程復(fù)雜、難度大，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能完成，所需的真空冷凍干燥機(jī)一般實(shí)驗(yàn)室難以配備，所以此方法適合于有條件的實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌種的長(zhǎng)期保存。

綜上所述， 一般微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)教學(xué)菌種的保存，可采用保存液低溫冷凍法，此方法操作簡(jiǎn)單，且無需專業(yè)設(shè)備，可保存數(shù)年，復(fù)蘇方便。有條件的實(shí)驗(yàn)保存教學(xué)菌種，可采用真空冷凍干燥低溫法，此方法要求較高的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作過程雖繁瑣，但保存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年，無需反復(fù)接種保存，菌種特性穩(wěn)定且不易發(fā)生變異，該方法最適合醫(yī)學(xué)微生物教學(xué)菌種的保存。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 彭俊華，薛榮麗，張媛媛，朱曉紅. 三種常用方法保存臨床常見菌種的比較 [J]. 甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)，2012， 24（3）：88-90.