汪城墻 黃嶠璟 呂剛 胡文豪 朱瑞敏 丁延芹 杜秉海

摘要：本試驗使用Illumina MiSeq測序平臺，選取我國東北三江平原地區(qū)的大田黑土、菜園黑土和森林黑土3種樣本，對不同耕種黑土表層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：大田土、菜園土和森林土的微生物群落存在明顯差異。大田土的群落豐富度明顯低于菜園土和森林土，后兩者相似度較高。大田土的OTU數(shù)比菜園土和森林土分別少13.3%和7.6%。菜園土的微生物群落組成種類最為豐富，森林土中硝化螺旋菌門含量最高，大田土微生物群落含有的外源性物質(zhì)降解相關(guān)基因相對豐度較高。可見，三江平原大田黑土的退化和土壤微生物群落的改變有關(guān)，調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)將有助于東北大田黑土的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌群落多樣性；高通量測序；黑土地；耕種模式

中圖分類號：S154.36文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0076-06

我國東北地區(qū)的黑土為世界上四大黑土地之一，是我國主要土壤類型之一，其土質(zhì)肥沃、質(zhì)地疏松，是重要的商品糧生產(chǎn)基地[1，2]，總面積達(dá)1.0×107 hm2[3]，由黑龍江、松花江和烏蘇里江沖積而成的三江平原是其中的重要組成部分。但由于我國長期實行的農(nóng)業(yè)耕作方式產(chǎn)生的一些弊端，尤其是長期單獨施用化肥，致使黑土肥力顯著下降，出現(xiàn)土壤板結(jié)、酸化、可耕性變差等土壤退化問題[4，5]，亟待解決。

土壤含有大量的微生物，包括細(xì)菌、放線菌、真菌、原生動物和顯微藻類等，其中細(xì)菌含量最高[6]，在黑土土壤中約占微生物總數(shù)的80%以上[7]。土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán)等多種生態(tài)過程中起著積極作用[8]。土壤微生物群落對生存環(huán)境的變化十分敏感，可以隨著環(huán)境變化做出響應(yīng)[9]，是衡量土壤生物學(xué)活性以及生產(chǎn)力的一項重要指標(biāo)[3]。土壤微生物群落多樣性即為土壤微生物活性指標(biāo)中最重要的因素[10]，在一定程度上反映土壤性能。有研究表明，長期不同的人為施肥制度對土壤的微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)影響顯著[11]，如：長期施入氮肥會降低土壤微生物活性；而植物殘體和糞肥等有機(jī)肥料的施入可維持土壤肥力及微生物系統(tǒng)穩(wěn)定，進(jìn)而可改善土壤微生態(tài)環(huán)境或提高土壤微生物群落功能多樣性[4，12，13]。對黑土土壤微生物群落功能多樣性進(jìn)行研究，可分析出微生物群落的功能，找出土壤肥力和土壤微生物之間的關(guān)系，對黑土土壤肥力及健康評價具有重要意義[2]，也可對退化黑土土壤進(jìn)行有效的微生物修復(fù)提供重要參考。近年來，對土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)與組成的研究備受關(guān)注。

本試驗研究了長期施用化肥并種植經(jīng)濟(jì)作物的大田表層黑土、長期施用農(nóng)家肥并種植蔬菜的菜園表層黑土以及森林表層黑土的細(xì)菌群落多樣性，分析長期不同耕種方式及人為干擾對三江平原黑土地表層細(xì)菌群落多樣性的影響，為三江平原大田黑土的微生物修復(fù)策略找到合適的微生物菌群、實現(xiàn)土地可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1取樣

取樣地點分布在黑龍江省鶴崗市蘿北縣軍川農(nóng)場（隸屬北大荒集團(tuán)），地處三江平原，介于東經(jīng)131°02′～131°30′、北緯47°20′～47°40′之間。選取樣本分為三類：森林土、菜園土以及大田土，分別編號為Ne1、Ne3和Ne4。森林土為東北寒溫帶原始森林地表層以下10～15 cm的黑土，菜園土為20世紀(jì)70年代開墾以來長期混種多種蔬菜和不定期施用不同種類農(nóng)家肥的地表層以下10～15 cm的黑土，大田土為開墾以來長期種植大豆和玉米兩種作物并施用化肥的地表層以下10～15 cm的黑土。取樣時間為2015年8月1日。土壤取出后立即于-20℃凍存，一個月內(nèi)完成分析工作。

1.2樣品處理

每種樣本選擇兩個生物學(xué)重復(fù)，用美國OMEGA公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取土壤總DNA，檢測合格后，采用Illumina MiSeq測序平臺，委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行土壤細(xì)菌多樣性檢測。

2結(jié)果與分析

2.1樣本測序數(shù)量的可信度

本試驗中測序分析選擇的測序數(shù)量為40 000條左右，從圖1稀釋曲線可以看出，所選測序斜率明顯變小，說明測定的各樣本能夠反映真實物種的豐富度，數(shù)據(jù)分析和處理合理、可信度高。

2.2Alpha多樣性分析

一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的微生物多樣性常用Alpha 多樣性來表示，可反映出豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。群落豐富度的指數(shù)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)均和樣本群落豐富度呈正比。群落多樣性的指數(shù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，分別和群落多樣性呈正比和反比。三種樣本在97%相似水平上的Alpha 多樣性分析結(jié)果見表1。樣本Ne3的Chao 指數(shù)和 ACE 指數(shù)最大，說明樣本中含有的OTU數(shù)多，即群落豐富度最高；其次是Ne1，最小的是Ne4。不同樣本的Simpson指數(shù)差別不大，Shannon指數(shù)具有Ne3、Ne4、Ne1依次減小的趨勢，群落多樣性逐漸降低。

2.3Beta多樣性分析

Beta 多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間的多樣性比較，可反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異。本試驗使用Qiime軟件對三組樣本之間物種的進(jìn)化以及豐度信息進(jìn)行 Unifrac分析[14]，得到樣本間差異的距離矩陣，然后對樣本之間的距離矩陣信息進(jìn)行 PCoA 分析和 NMDS 分析，對PCoA分析的結(jié)果繪制出3D 圖（圖2A），對 NMDS 分析的結(jié)果利用 R 軟件繪制出NMDS 圖（圖2B）。圖中的每個點代表一個樣本，顏色相同的點屬于同一種分組，三樣本組的兩個生物學(xué)重復(fù)之間的距離較近，三種樣本間的距離相對較遠(yuǎn)，說明三種樣本間的微生物群落存在差異。

2.4樣本群落組成分析

根據(jù)測序得到的 OTU結(jié)果，可以得到各種樣本在各分類水平上，即門、綱、目、科、屬上的物種組成比例情況，反映樣本在不同分類學(xué)水平上的群落組成結(jié)構(gòu)。Ne1、Ne3和Ne4三種樣本中檢測到的細(xì)菌門數(shù)分別為38、40、39；細(xì)菌綱數(shù)分別為115、119、109；細(xì)菌目數(shù)分別為166、168、161；細(xì)菌科數(shù)分別為200、213、202；細(xì)菌屬數(shù)分別為241、270、257；細(xì)菌種數(shù)分別為78、87、81。在各分類水平上，Ne3都表現(xiàn)出最多的數(shù)量；在綱、目水平上，Ne1比Ne4表現(xiàn)出一定數(shù)量優(yōu)勢；在科、屬和種水平上，Ne4比Ne1表現(xiàn)出數(shù)量優(yōu)勢。

由圖3可以看出，在Ne1、Ne3和Ne4三組樣本中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）含量最多，分別占到60.5%、63.75%、66.39%。疣微菌門（Verrucomicrobia）在Ne1、Ne3和Ne4中差異顯著，含量分別為10.02%、3.33%和3.08%。酸桿菌門（Acidobacteria）含量差別也較大，在Ne1、Ne3和Ne4中的含量分別為6.33%、7.68%和4.92%。綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）在三個樣本Ne1、Ne3和Ne4中含量具有逐漸增多趨勢。Ne1中的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）含量為0.75%，明顯高于Ne3和Ne4中的0.35%和0.17%；Ne1中的熱袍菌門（Thermotogae）也明顯高于Ne3和Ne4；而厚壁菌門（Firmicutes）的含量只為Ne3和Ne4的約一半。Ne3中綠菌門（Chlorobi）含量明顯低于Ne1和Ne4，而衣原體門（Chlamydiae）和梭桿菌門（Fusobacteria）的含量明顯高于Ne1和Ne4，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的含量也略高于Ne1和Ne4。Ne4中螺旋體門（Spirochaetes）較高于Ne1和Ne3。另外，在Ne1中未檢測到纖維桿菌門（Fibrobacteres）和互養(yǎng)菌門（Synergistetes），在Ne4中未檢測到脫鐵桿菌門（Deferribacteres），總體上來看，菜園土Ne3中的細(xì)菌門水平上種類最為豐富。

2.5樣本間的OTU 聚類分析

本試驗利用R軟件在97%的相似水平上對樣本Ne1、Ne3和Ne4序列進(jìn)行 OTU 的聚類分析，生成樣本間OTU 的維恩圖，分析菌種數(shù)目[10]，結(jié)果見圖4。樣本Ne1、Ne3和Ne4中的OTU數(shù)分別為4 498、4 791和4 156。Ne4的OTU數(shù)比Ne1和Ne3分別減少7.6%和13.3%，Ne3的比Ne1高6.5%。樣本Ne1、Ne3和Ne4共有的OTU數(shù)為2 351。樣本Ne1、Ne3和Ne4特有的OTU數(shù)分別為754、872和568。Ne4和Ne3共有OTU數(shù)為3 057，和Ne1共有2 882。Ne1和Ne3共有OTU數(shù)為3 213，明顯高于兩樣本和Ne4的共有數(shù)量。

應(yīng)用軟件R將三組樣本屬水平上的分類信息進(jìn)行聚類，繪制 heatmap 熱圖，見圖5。熱圖 heatmap用顏色變化直觀地將數(shù)據(jù)值大小表示出來，將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，反映三樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性。結(jié)果顯示，相比于人類耕種的樣本Ne3和Ne4，天然樣本Ne1的甲基桿菌屬（Methylobacterium）、特呂珀菌屬（Truepera）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、Azohydromonas和黃桿菌屬（Flavobacterium）的物種豐度較高。相比于大田樣本Ne4，樣本Ne1和Ne3的新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、特呂珀菌屬（Truepera）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、Azohydromonas和黃桿菌屬（Flavobacterium）豐度較高。相比于Ne1和Ne4，菜園土樣本Ne3的Kaistobacter、出芽菌屬（Gemmata）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、豐佑菌屬（Opitutus）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）豐度較高。不同樣本之間細(xì)菌屬的類別存在較大差異。大田土Ne4與菜園土Ne3、森林土Ne1的相似度較低，而菜園土Ne3和森林土Ne1的相似度較高。

2.6群落功能基因預(yù)測

基于宏基因組的物種豐度信息以及物種的基因組數(shù)據(jù)庫信息，預(yù)測三樣品群落的功能基因組成。根據(jù)OTU水平的豐度信息，利用軟件PICRUSt[15]進(jìn)行功能基因的預(yù)測和相關(guān)統(tǒng)計分析，更加深入地了解樣本的微生物群落并可比較樣本在功能基因方面的差異，結(jié)果見圖6。

轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因、折疊分揀以及講解相關(guān)基因、質(zhì)代謝相關(guān)基因、多糖生物合成和代謝相關(guān)基因有由樣本Ne1、Ne3和Ne4相對豐度逐漸減少的趨勢。外源性物質(zhì)降解和代謝相關(guān)基因、氨基酸代謝相關(guān)基因有由樣本Ne1、Ne3和Ne4相對豐度逐漸增加的趨勢。Ne3樣本中，細(xì)胞運動性相關(guān)基因、復(fù)制和修復(fù)相關(guān)基因相對豐度較高，膜運輸基因較少。

3討論與結(jié)論

我國大田耕作中，大量施用化肥以及長期耕種，造成東北黑土壤的活力退化，也勢必改變其中的微生物群落多樣性。通過對比原始森林黑土以及良性耕作的菜園黑土的微生物群落，可以認(rèn)識和了解長期大田耕作黑土微生物群落多樣性的改變，對后續(xù)的微生物修復(fù)具有積極的理論意義。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所采集的三江平原大田黑土、菜園黑土和森林黑土三種樣本間的微生物群落存在明顯差異。大田土的群落豐富度明顯低于菜園土和森林土，后兩者相似度較高，菜園土的群落豐富度最高，與已報道的趨勢一致[13， 16]。通過OTU聚類分析顯示，大田土的OTU數(shù)比菜園土和森林土分別少13.3%和7.6%。從樣本微生物群落組成分析，大田土的微生物群落中，綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）和螺旋體門（Spirochaetes）含量較多，疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）含量較少，未檢測到脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。森林土中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）含量最高，分別約為菜園土和大田土的2倍和4倍，這可能有利于自然界中森林土的自身氮素循環(huán)，而大田土和菜園土可能受長期施加不同種類氮素肥料的影響。總體上來看，菜園土的微生物種類最為豐富，這可能跟其種植作物多樣性和施用的農(nóng)家肥種類多樣性相關(guān)，其中，衣原體門（Chlamydiae）和梭桿菌門（Fusobacteria）的含量明顯高于森林土和大田土，這可能跟菜園土施加農(nóng)家肥引入一些動物源豐富的微生物所致。群落功能基因預(yù)測結(jié)果也顯示出三種土樣一些功能基因的差異，其中，大田土的外源性物質(zhì)降解相關(guān)基因相對豐度較高，這可能是由于長期耕種模式下，大田土中產(chǎn)生了一些外源性有害物質(zhì)，刺激微生物群落中降解相應(yīng)物質(zhì)的微生物的含量增加。

東北黑土地因長期的農(nóng)業(yè)耕作發(fā)生了變化，也造成了土壤微生物群落和功能的改變。良性的菜園耕種模式對東北黑土可以起到積極的效果，而長期施加化肥的大田耕作模式則起到負(fù)面效果。推測施用大田土差異顯著的微生物菌群肥料或菌劑，代替或部分代替化學(xué)肥料，調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，將有助于東北耕地黑土的微生物修復(fù)，進(jìn)而提高糧食產(chǎn)量。

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