肖安 彭蓉蓉

[摘要] 目的 本研究旨在進(jìn)一步研究闡明MicroRNA-421相對表達(dá)量與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。 方法 我院乳腺外科行乳腺癌手術(shù)切除患者的病例樣本共計96例（從2012年1月～2015年1月），對96例乳腺癌病例采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法對MicroRNA-421的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，運用Kaplan-Meier的生存曲線對腫瘤切除術(shù)后患者的生存情況進(jìn)行分析。 結(jié)果 MicroRNA-421相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、分化、瘤組織大小等并不存在相關(guān)性（t=1.52，P=0.32；t=0.42，P=0.75；t=1.28，P=0.94；t=-1.22，P=0.12）；而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)（t=2.93，P=0.01<0.05），而無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的相對表達(dá)量與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.36，P=0.98>0.05），MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險有關(guān)；生存分析方面，42例MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而MicroRNA-421高表達(dá)的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MicroRNA-421表達(dá)的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性。 結(jié)論 MicroRNA-421相對表達(dá)量水平與乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著相關(guān)性，MicroRNA-421的下調(diào)可能有潛在抑癌基因的作用，可作為乳腺癌診斷和預(yù)后的新型標(biāo)志物，需要進(jìn)一步的研究驗證。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；MicroRNA-421；下調(diào)；預(yù)后

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）08-0022-04

乳腺癌是來源于上皮組織最常見的惡性腫瘤之一，我國的乳腺癌發(fā)病率一直居高不下，每年死于乳腺癌的患者超過26萬，每年新發(fā)的乳腺癌約為100萬例，盡管對乳腺癌的診斷和治療技術(shù)不斷的提高，但是該病的預(yù)后仍不理想，多數(shù)患者患病后初次就診已經(jīng)伴有廣泛的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移，就已處于該病的晚期，失去根治手術(shù)的機(jī)會，耽誤了治療的最佳的時機(jī)，早期診斷對疾病的及時發(fā)現(xiàn)及治療具有重要的臨床意義[1-3]。MicroRNA是一類長度約為22nt的單鏈非編碼的小分子RNA，通過與靶基因mRNA-3UTR結(jié)合，降低或抑制mRNA的翻譯，從而起到負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。目前普遍認(rèn)為MicroRNA在致癌和抑癌方面有著重要的調(diào)控作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵性作用，為此學(xué)術(shù)界對MicroRNA進(jìn)行不斷深入研究，與乳腺癌相關(guān)的越來越多的MicroRNA被發(fā)現(xiàn)，提高了乳腺癌診斷和治療的水平[4，5]。為了探討MicroRNA與乳腺癌的相關(guān)性，我們前期通過基因芯片技術(shù)，檢測乳腺癌的MicroRNA表達(dá)譜，對其配對樣本的患者芯片進(jìn)行分析，實驗研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織與正常胃組織相比，上調(diào)的MicroRNA共有57個，其中上調(diào)>2倍的有14個，下調(diào)的MicroRNA共有42個，其中下調(diào)>2倍的有12個，其中MicroRNA-421下調(diào)最明顯，下調(diào)了8.25倍。因此推測MicroRNA-421在乳腺癌的發(fā)病中通過下調(diào)表達(dá)而作為抑癌基因發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用。初步確定MicroRNA-421作為研究的重點，為進(jìn)一步闡明乳腺癌發(fā)病病理因素及生存預(yù)后與MicroRNA-421相對表達(dá)量之間的關(guān)系，納入我院普外科行乳腺癌手術(shù)切除患者的病例樣本共計96例，對96例乳腺癌病例采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)法對MicroRNA-421的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，運用Kaplan-Meier生存曲線對腫瘤切除術(shù)后患者的生存情況進(jìn)行分析，初步探討MicroRNA-421的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展之間的作用關(guān)系，為進(jìn)一步的靶基因預(yù)測等深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入我院2012年1月～2015年1月乳腺外科行乳腺癌手術(shù)切除患者的病例樣本共計96例，通過病理診斷分析均為原發(fā)性乳腺癌，所有患者均為初診，術(shù)前未進(jìn)行任何放療、化療及分子靶向治療等。年齡38～56歲，平均（46.34±1.13）歲。收集標(biāo)本前該臨床試驗研究通過了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有病例患者簽訂知情同意書。在術(shù)中取材之后，腫瘤位置以病理組織報告為標(biāo)準(zhǔn)，將樣本立即放置入液氮罐中保存，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長期保存，在實驗前取出，提取乳腺癌組織的MicroRNA，同時進(jìn)行病理學(xué)的監(jiān)測，對乳腺癌組織的病理學(xué)進(jìn)行分型，腫瘤的浸潤程度按照國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)分類，淋巴分化以及轉(zhuǎn)移采用國際WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析判斷，對所有手術(shù)治療的患者從出院到死亡進(jìn)行隨訪觀察，以1年內(nèi)每3個月1次、2年內(nèi)每半年1次進(jìn)行隨防，終生隨訪。

1.2 實驗試劑和儀器

1.2.1 試劑 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美國Invitroge公司），TaqMix（東盛生物公司），PCR試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒（美國Santa Cruz公司），RNA提取試劑盒采用（美國Sigma），DEPC（上海碧云天生物），乙醇、異丙醇、氯仿（上海碩盟生物）。

1.2.2 儀器 倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯），高速冷凍離心機(jī)（德國Biofuge Stratos），-80℃、-4℃冰箱（日本松下），高壓消毒箱（美國Tuttnauer），轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀（美國伯樂公司），PCR儀（澳大利亞Rotor-gene），紫外分光光度儀（Beckman Coulter 公司）。

1.3 RNA提取及RT-PCR反應(yīng)

對乳腺癌組織采用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，采用TaqMan MicroRNA試劑盒檢測MicroRNA-421在患者乳腺癌組織中的表達(dá)情況。內(nèi)參校正：RT-PCR反應(yīng)每個樣本量取10 ng的RNA提取量，由于實驗測試過程中受到RNA逆轉(zhuǎn)錄效率、RNA濃度定量誤差以及每個樣品等體積的cDNA的含量不同等系統(tǒng)誤差的影響，我們采用RNU6作為實驗內(nèi)參。對MicroRNA-421的表達(dá)水平采用二步法進(jìn)行檢測，第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補(bǔ)cDNA，再通過MicroRNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)了反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在PCR管加入10 μL的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 ng/μL，最后加入5 μL的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減，第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman miRNA的特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，cDNA共5 μL加入到RNA的去酶的水當(dāng)中，將體積擴(kuò)增至20 μL，通過循環(huán)反應(yīng)94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減的擴(kuò)張40個循環(huán)之后，對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，采用實時定量反應(yīng)，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應(yīng)當(dāng)在20～32之外的需要進(jìn)行第二次檢測。應(yīng)用ΔCt=CtMicroRNA-421-CtRNU6的計算公式計算MicroRNA-421的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件全部數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)文件，將MicroRNA-421表達(dá)水平分為兩組，小于平均值為低表達(dá)組，大于平均值作為高表達(dá)組。通過分析MicroRNA-421的表達(dá)水平高低與發(fā)病相關(guān)因素分析以逐步回歸法篩選有統(tǒng)計學(xué)意義的變量，對臨床病理因素之間的風(fēng)險情況采用Logistic回歸分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗或方差分析，組間率的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA-421的相對表達(dá)量與臨床病理特征之間的相關(guān)性

乳腺癌組織的MicroRNA-421的相對表達(dá)量為0.436（95%CI 0.323～0.534），表達(dá)量低于平均值42例，高于平均值54例，MicroRNA-421相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、分化程度、瘤組織大小并不存在相關(guān)性（P>0.05）；而在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)（P<0.05），而無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的相對表達(dá)量與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險有關(guān)，見表1。

2.2 MicroRNA-421相對表達(dá)量的高低與臨床病理因素之間的關(guān)系

采用Logistic回歸分析方法分析MicroRNA-421相對表達(dá)量的高低與臨床病理因素之間的相關(guān)性，MicroRNA-421相對表達(dá)量的高低增加了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險（OR=5.16，95%CI為1.27～20.83，P=0.03），見表2。

2.3 MicroRNA-421的相對表達(dá)量與預(yù)后之間的相關(guān)性

96例乳腺癌組織的MicroRNA-421的相對表達(dá)量為0.436，95%CI為（0.323～0.534）表達(dá)量低于平均值42例，高于平均值54例，MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)的患者中生存時間為（37.34±10.90）個月，而MicroRNA-421高表達(dá)的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.398，P=0.026），MicroRNA-421表達(dá)的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性，見封三圖5。

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)惡性腫瘤，中國抗癌協(xié)會公布的統(tǒng)計數(shù)字顯示，我國主要城市10年來乳腺癌發(fā)病率增長了37%，死亡率增長了38.9%。2011年美國CA雜志（A Cancer Journal for Clinicians雜志，2010年影響因子94.262）公布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國2011年預(yù)計將有230 480例女性罹患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%，大部分乳腺癌患者初次入院檢查已經(jīng)是中晚期，因此探求研究乳腺癌發(fā)病的機(jī)制具有重要的現(xiàn)實意義[6-10]。通過大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA是一類能夠調(diào)節(jié)多種靶基因發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要分子，也是目前腫瘤分子機(jī)制的研究熱點內(nèi)容[11-13]。最近研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA作為新型的非編碼的單鏈RNA在乳腺癌標(biāo)志的研究當(dāng)中取得了一定的進(jìn)展，已有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌異性的MicroRNA表達(dá)譜可用于腫瘤的診斷和分型當(dāng)中，差異性表達(dá)的MicroRNA對乳腺癌的亞型、轉(zhuǎn)移以及病理改變具有重要的意義，尤其是在術(shù)后復(fù)發(fā)率及生存期應(yīng)用中可起到預(yù)后評估的作用。研究還提示MicroRNA相對表達(dá)量與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后有著重要關(guān)系，組織分型結(jié)果可見，其中MicroRNA-125b、MicroRNA-56a、MicroRNA-33的高表達(dá)對于乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著重要的價值。MicroRNA涉及到各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且MicroRNA的表達(dá)譜還決定著腫瘤基因表達(dá)，在腫瘤亞型、轉(zhuǎn)移等臨床病理因素中發(fā)揮著重要作用，尤其對于術(shù)后的生存期及預(yù)后具有一定的相關(guān)性，研究提示了MicroRNA可以用于對腫瘤預(yù)后的評估，其表達(dá)量與腫瘤的預(yù)后有著一定的相關(guān)性[14，15]。

MicroRNA所具有的腫瘤調(diào)控作用是通過與其靶向的MicroRNA的MicroRNA-3UTR結(jié)合活編碼區(qū)的子序列堿基配對相關(guān)，主要通過負(fù)調(diào)控MicroRNA對整個相關(guān)基因表達(dá)體系發(fā)揮著精細(xì)調(diào)節(jié)的作用[19]。通過負(fù)調(diào)控靶基因，而促進(jìn)靶基因的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而抑制過表達(dá)的MicroRNA，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移侵襲能力。我們通過高通量篩選技術(shù)篩查出了與乳腺癌相關(guān)的Micro- RNA-421，該分子是MicroRNA-200家族中的重要成員，其編碼定位在人的1號染色體（1p34.23）上，多種腫瘤都出現(xiàn)該區(qū)域，以往研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-421在不同腫瘤組織中均有差異性表達(dá)，其調(diào)控功能也有所不同[16，17]。有文獻(xiàn)報道MicroRNA-421的下調(diào)在結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等中具有預(yù)后判斷價值。研究還發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中MicroRNA-421表達(dá)的下調(diào)可作為膀胱癌晚期的標(biāo)志性分子[18]，過表達(dá)的MicroRNA-421可以子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，還可提高順鉑對子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞毒作用，提示MicroRNA-421在腫瘤的調(diào)控中具有重要的作用。本研究主要探討MicroRNA-421在乳腺癌中發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用，結(jié)果顯示MicroRNA-421相對表達(dá)量與患者的年齡、性別、分化程度及瘤組織大小等并不存在相關(guān)性（P>0.05）；而在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)，而無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的相對表達(dá)量與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險有關(guān)；在生存分析方面，42例MicroRNA-421相對表達(dá)量明顯下調(diào)的患者中位生存時間為（37.34±10.90）個月，而MicroRNA-421高表達(dá)的患者生存時間為（54.23±12.43）個月，MicroRNA-421表達(dá)的高低與預(yù)后有著一定的相關(guān)性。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MicroRNA-421在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，與組織分化及預(yù)后有著密切的相關(guān)性，提示MicroRNA-421可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲等影響預(yù)后的因素有關(guān)，該分子差異性表達(dá)推測其可能是乳腺癌早期的潛在靶點，但是本研究不足的是病例數(shù)還相對較少，MicroRNA-421在乳腺癌中的作用機(jī)制及靶基因生物學(xué)預(yù)測和闡明有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Brandl A，Wittmann J，J？覿ck HM. A facile method to increase titers of MicroRNA-encoding retroviruses by inhibition of the RNaseIII enzyme Drosha[J]. Eur J Immunol，2012， 41（2）：549-551.

[2] Min H，Yoon S. Got target Computational methods for microRNA target prediction and their extension[J]. Exp Mol Med，2013，42（4）：233-244.

[3] Maere S，Heymans K，Kuiper M. BiNGO：A Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks[J]. Bioinformatics，2014，21（16）：3448-3449.

[4] Sethupathy P，Megraw M，Hatzigeorgiou AG. A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets[J]. Nat Methods，2011，3（11）：881-886.

[5] Fassi Fehri L，Koch M，Belogolova E，et al. Helicobacter pylori induces miR-155 in T cells in a cAMP-Foxp3-dependent manner[J]. PLoS One，2010，5（3）：e9500.

[6] Valeri N，Gasparini P，F(xiàn)abbri M，et al. Modulation of mismatch repair and genomic stability by miR-155[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，107（15）：6982-6987.

[7] Du Y，Xu Y，Ding L，et al. Down-regulation of miR-141 in gastric cancer and its involvement in cell growth[J]. J Gastroenterol，2009，44（6）：556-561.

[8] Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol，2013，11（2）：136-146.

[9] Wu CX，Zheng Y，Bao PP. Pattern of changing incidence of gastric cancer and its time trend in Shanghai[J]. J Sur Concepts Prat，2012，13（1）：24-29.

[10] Lee JW，Park YA，Choi JJ，et al. The expression of the miRNA-200 family in endometrial endometrioid carcinoma[J]. Gynecol Oncol，2014，120（1）：56-62.

[11] Bockmeyer CL，Christgen M，Müller M，et al. MicroRNA profiles of healthy basal and luminal mammary epithelial cells are distinct and reflected in different breast cancer subtypes[J]. Breast Cancer Res Treat，2011，130（3）：735-745.

[12] Sun T，Wang C，Xing J，et al. MiR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Eur J Cancer，2012，47（17）：2552-2559.

[13] Mees ST，Mardin WA，Wendel C，et al. EP300-a miRNA-regulated metastasis suppressor gene in ductal adenocarcinomas of the pancreas[J]. Int J Cancer，2010，126（1）：114-124.

[14] Baek D，Villén J，Shin C，et al. The impact of microRNAs on protein output[J]. Nature，2013，455（7209）：64-71.

[15] Ouyang G，Wang Z，F(xiàn)ang X，et al. Molecular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells[J]. Cell Mol Life Sci，2010，67（15）：2605-2618.

[16] Manning G，Whyte DB，Martinez R，et al. The protein kinase complement of the human genome[J]. Science，2012， 298（5600）：1912-1934.

[17] Krishnamachary B，Zagzag D，Nagasawa H，et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent repression of E-cadherin in von Hippel-Lin-dau tumor suppressor-null renal cell carcinoma mediated by TCF3，ZFHX1A，and ZFHX1B[J].Cancer Res，2011，66（5）：2725-2731.

[18] Krek A，Grun D，Poy MN，et al. Combinatorial microRNA target predictions[J]. Nat Genet，2005，37（5）：495-500.

[19] Ohashi S，Natsuizaka M，Naganuma S，et al. A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J]. Cancer Res，2013，71（21）：6836-6847.

（收稿日期：2015-09-02）