邢宏微 王海生

DOI：10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.08.106

[摘要] 目的 該文主要為了研究2型糖尿病患者外周血巨噬細(xì)胞中是否有ERK及STAT3通路的磷酸化激活。方法 收集30例2型糖尿病患者及30名健康體檢者的病例資料，提取兩管肘靜脈血。①離心收集上清液用ELISA法檢驗(yàn)TNF-α及IL-6的分泌水平；②收集單核細(xì)胞，培養(yǎng)出巨噬細(xì)胞；③提取蛋白，Western blot 法檢測(cè) ERK、p-ERK、STAT3及p-STAT3的表達(dá)情況。 結(jié)果 ①與對(duì)照組比較而言，病例組中炎性因子TNF-α及IL-6的分泌顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②糖尿病患者外周血巨噬細(xì)胞中普遍存在ERK及STAT3通路的磷酸化激活，但兩種蛋白的總體表達(dá)水平卻未見(jiàn)異常，半定量分析后發(fā)現(xiàn)，藥物組中磷酸化蛋白/總蛋白的含量比值與對(duì)照組中兩者比值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 ERK及STAT3兩條通路均參與了2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 2型糖尿??；腫瘤壞死因子α；白介素6；p-ERK；p-STAT3

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2016）04（b）-0106-03

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 收集病例、提取外周血

收集病例資料，提取兩管肘靜脈血，淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞后換液，留存貼壁的單核細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1640培養(yǎng)細(xì)胞，每2～3 d傳代，待細(xì)胞貼壁達(dá)到90%左右時(shí)實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞

96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，甲醛固定，5%BSA封閉，加入CD11b過(guò)夜，二抗孵育，洗板，加入Hoechst染色劑2 uL，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 ELISA檢測(cè)TNF-α及IL-6的分泌

按照TNF-α及IL-6的使用說(shuō)明，在抗體包被的96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣本、生物標(biāo)記二抗及酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)1 h，洗板，加顯色劑，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的光密度值。

1.5 Western blot檢測(cè)p-ERK、ERK、STAT3及p-STAT3的表達(dá)

分別收集細(xì)胞，配制等體積等濃度的待測(cè)蛋白，配膠、電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉，敷一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗膜，二抗孵育，ECL發(fā)光。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0及ImageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，各組間的總體均值采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 免疫熒光結(jié)果

見(jiàn)圖1。熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞為單層貼壁細(xì)胞，胞體細(xì)長(zhǎng)呈梭形，發(fā)出較多分支。

2.2 ELISA檢測(cè)炎癥因子

表達(dá)結(jié)果如下圖2、圖3。A：病例組，B：對(duì)照組：與對(duì)照組比較而言，病例組中炎性因子TNF-α分泌顯著增高，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Western blot 結(jié)果

圖4A。ERK及p-ERK條帶圖，如下圖5A。STAT3及p-STAT3條帶圖，如下所示。

3 討論

超重是糖尿病的危險(xiǎn)因素之一，而大部分降糖藥物都會(huì)引起病人體重增加[4]。2型糖尿病是一種多基因遺傳傾向性疾病[5]，目前已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)候選基因與2型糖尿病有關(guān)聯(lián)，目前世界許多國(guó)家都在致力于此方面的研究[6]，眾所周知，炎癥與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)[7]，但與2型糖尿病相關(guān)的炎癥通路目前研究不多，我們的研究正是基于這樣的考慮，相信不久的將來(lái)會(huì)為我們防治或延緩2型糖尿病的發(fā)生提供理論依據(jù)。

該實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)ELISA法檢測(cè)了炎性因子TNF-α及IL-6的分泌情況（見(jiàn)圖2，圖3），進(jìn)而證實(shí)了炎癥參與了2型糖尿病的發(fā)生及進(jìn)展，接下來(lái)提取外周血單核細(xì)胞，并用CD11b對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行特異性染色（如圖1，a、b、c），證明巨噬細(xì)胞被成功提取，收集細(xì)胞，提取蛋白，Western blot法檢測(cè)ERK、p-ERK、STAT3及p-STAT3的蛋白分泌情況（圖4a、4b、5a、5b），證明在2型糖尿病伴肥胖的患者中是否存在炎癥通路ERK及STAT3的磷酸化激活。為糖尿病的診斷及治療提供了新的治療方向，臨床意義深遠(yuǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王蕾，羅坤年.2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血脂與尿微量白蛋白的關(guān)系[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2001，16（1）：24-25.

[2] Rapoport， Ferreira.PD98059 prevents neurite degeneration induced by fibrillar beta-amyloid in mature hippocampal neurons[J].Journal of Neurochemistry，2000，74（1）：125-133.

[3] C X Tao，W Nian-Song，F(xiàn) Li-Li，et al. -elecoxib inhibits growth of human autosomal dominant polycystic kidney cyst-lining epithelial cells through the VEGF/Raf/MAPK/ERK signaling pathway[J].Molecular Biology Reports[J].2012，39（7）：7743-7753.

[4] W Tian，Z Zhang，DM Cohen .MAPK signaling and the kidney[J].American Journal of Physiology Renal Physiology，2000（4）：593-604.

[5] Q Zhao，Y Wan，C Wang，et al. Regulatory mechanism of p38MAPK signaling pathway on renal tissue inflammation in chronic kidney disease and interventional effect of traditional Chinese medicine[J].China Journal of Chinese Materia Medica， 2012，37（12）.

[6] 曾凱宏.許紅霞.?；撬嵋种铺悄虿〈笫笠暰W(wǎng)膜Muller細(xì)胞VEGF表達(dá)的研究[J].生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（4）：601-604.

[7] YO lbey，E Ozbek，A Sim ek.Pyrrolidine dithiocarbamate treatment prevents ethylene glycol-induced urolithiasis through inhibition of NF-kB and p38-MAPK signaling pathways in rat kidney[M].Archivio italiano di urologia， andrologia： organo ufficiale，2010：82.

（收稿日期：2016-01-18）