帥智峰　韓翠翠　張曉杰

【摘要】 目的：利用微流控芯片平臺探索腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）影響人胃癌SGC7901細胞對化療藥物的耐藥及其與GRP78表達的相關性，從而為臨床工作提供以CAFs和GRP78為靶點來改善腫瘤耐藥的新思路。方法：本實驗自主設計了一個可用于藥敏檢測及蛋白半定量的三維聯(lián)合共培養(yǎng)微流控芯片體系，通過灌注細胞懸液-凝膠混合物于三維培養(yǎng)池內來實現(xiàn)胃癌細胞系的三維培養(yǎng)。應用凋亡染色方法檢測SGC7901細胞單獨培養(yǎng)組（對照組）、SGC7901細胞+NFs共培養(yǎng)組、SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組中SGC7901細胞對不同濃度的化療藥物順鉑的藥物敏感情況。應用免疫熒光法檢測對照組和實驗組SGC7901細胞GRP78表達。結果：SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細胞對順鉑的敏感性較SGC7901細胞單獨培養(yǎng)時低（P<0.05），SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組SGC7901細胞中GRP78蛋白表達較對照組升高（P<0.05）。結論：CAFs可以誘導人胃癌SGC7901細胞對順鉑耐藥；CAFs可能通過上調人胃癌SGC7901細胞中GRP78的表達而導致耐藥。

【關鍵詞】 微流控芯片； 腫瘤相關成纖維細胞； 胃癌； 耐藥

The Relevance of CAFs Influencing the Drug Resistant of Gastric Cancer Cells and the GRP-78 Expression Based on Microfluidic Chip/SHUAI Zhi-feng，HAN Cui-cui，ZHANG Xiao-jie.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：005-008

【Abstract】 Objective：The platform of microfluidic chip is used to explore the relevance of cancer-associated fibroblasts（CAFs） influencing the resisitence of human gastric cancer SGC7901 cells to chemotherapy drugs and the expression of GRP-78，to provide the new idea that CAFs and GRP78 as targets improve tumor drug resistance for clinical work.Method：A microfluidic chip system of three-dimensional co-culture was designed independently which could be used for drug sensitive detection and protein semi-quantitative in this experiment.Three-dimensional culture of gastric cancer cell line was achieved by perfusing cell suspension-gel mixture.Apoptosis staining was applied to detect the sensitivity of SGC7901 cells to chemotherapeutic drugs cisplatin with different concentrations in separate culture group of SGC7901 cells（the control group），co-culture group of SGC7901 cells and NFs，co-culture group of SGC7901 cells and CAFs.The expressions of GRP78 in the control group and experimental group were detected by immunofluorescent assay.Result：Compared with the control group，the sensitivity of human gastric cancer SGC7901 cells to cisplatin in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was obviously lower than that in the control group（P<0.05）.Compared with the control group，the GRP78 expressions of SGC7901 cells in the co-culture group of SGC7901 cells and CAFs was distinctly higher（P<0.05）.Conclusion：CAFs can induce the drug resistance of SGC7901 cells to cisplatin； CAFs may lead to drug resistance by up-regulating the GRP78 expression in human gastric cancer SGC7901 cells.

【Key words】 Microfluidic chip； Cancer-associated fibroblasts； Gastric cancer； Drug resistance

First-authors address：Basic Medical College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.002

胃癌是我國最常見和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-2]，嚴重影響人們的生命和健康。化療是治療進展期和轉移性胃癌的主要方法，但現(xiàn)應用5-FU、順鉑和紫杉醇為基礎的各種聯(lián)合化療方案的總體有效率只有20%～40%，腫瘤細胞對化療藥物產生耐受性常常導致化療失敗[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等過程中均起到了重要作用，并可能與腫瘤的耐藥性相關[5-6]。微流控芯片是一種在微米尺度空間對流體進行操縱為主要特征的科學技術，由于芯片中流體通道直徑與細胞生長所需空間相適宜，通過連續(xù)動態(tài)供養(yǎng)、多種細胞的三維共培養(yǎng)，使細胞生長環(huán)境更加類似于其在體內的真實生長狀態(tài)[7]。因此，本研究擬通過微流控芯片平臺進行CAFs、NFs和胃癌細胞共培養(yǎng)，來探索CAFs影響胃癌細胞對化療藥物的耐藥及其與GRP78表達的相關性，從而為臨床工作提供以CAFs和GRP78為靶點來改善腫瘤耐藥的新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系 人胃癌細胞系SGC7901細胞，為齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院提供。

1.1.2 新鮮組織獲取 人新鮮胃癌組織來源于本院附屬醫(yī)院腫瘤外科，人包皮新鮮組織來源于本院附屬醫(yī)院泌尿外科，均由術中獲取，獲取前經(jīng)患者或家屬知情同意和本單位倫理委員會許可。

1.1.3 主要試劑 優(yōu)質胎牛血清、碘化丙碇（PI）染色劑、羊抗人GRP78抗體、鼠抗人平滑肌肌動蛋白抗體SMA和鼠抗人β-actin抗體均購自Sigma公司；FITC標記熒光二抗、辣根酶IgG抗體、蛋白提取劑試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天公司；基底膜提取物（BME）購自R&D Systems公司；RPMI1640和IMDM基礎培養(yǎng)液購自hyclone公司；順鉑購自Aladdin公司。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的構建與處理 本課題組設計了微流控芯片CAD圖形，并交于大連海事大學基于標準軟光刻技術制作SU-8負膠模板。此設計用于藥敏檢測及蛋白半定量的三維聯(lián)合共培養(yǎng)微流控芯片體系，通過灌注細胞懸液-凝膠混合物于三維培養(yǎng)池內來實現(xiàn)胃癌細胞系的三維培養(yǎng)；通過中部連接通道上的二維培養(yǎng)單元來實現(xiàn)成CAFs、NFs與胃癌細胞的非接觸式共培養(yǎng)；并通過微型注射泵持續(xù)注入實現(xiàn)流動實時營養(yǎng)物供給，使細胞所處的環(huán)境更加接近體內腫瘤微環(huán)境，以便模擬人體內腫瘤的真實狀況。主要方法：于模板上制作PDMS基片，等離子清洗活化PDMS基片和玻璃載玻片，使之相互鍵合，完成芯片制備過程。使用前，向芯片的進液孔注入無水乙醇并使之充滿整個通道，然后用蒸餾水沖洗乙醇，操作3次，將芯片于高壓蒸汽鍋內高壓滅菌，烘箱中烘干，紫外消毒后使用。微流控芯片及局部結構示意圖見圖1。

1.2.2 實驗分組 實驗分單培養(yǎng)組（對照組）和共培養(yǎng)組（實驗組）。對照組為單培養(yǎng)組（胃癌細胞系SGC7901細胞），共培養(yǎng)組分為SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組、SGC7901細胞+NFs共培養(yǎng)組。

1.2.3 藥敏檢測 三組芯片中各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后，通過MS26微量泵經(jīng)芯片藥物入口將順鉑泵入芯片，將芯片置于孵箱內誘導48 h。PBS注入芯片，沖洗細胞后向芯片中注入PI染液，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 耐藥相關蛋白表達 三組芯片中各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后，免疫熒光檢測各實驗組細胞中GRP78蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 順鉑藥物敏感性的檢測 為了驗證CAFs對腫瘤細胞藥物敏感性的影響，筆者把各實驗組細胞用順鉑作用48 h，PI染色后熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細胞對順鉑的敏感性較SGC7901細胞單獨培養(yǎng)時低（P<0.05），見圖2。

2.2 GRP78蛋白表達的檢測 為了驗證CAFs和SGC7901細胞共培養(yǎng)后對SGC7901細胞中GRP78蛋白表達的影響，以及探討GRP78的表達與CAFs引起的腫瘤細胞對順鉑耐藥的相關性，用芯片平臺免疫熒光法檢測SGC7901細胞GRP78蛋白表達水平。SGC7901細胞+CAFs共培養(yǎng)組SGC7901細胞中GRP78蛋白表達較對照組升高（P<0.05），見圖3。

3 討論

胃癌的發(fā)病率占消化系統(tǒng)腫瘤的第一位，是我國死亡率最高的惡性腫瘤之一。早期胃癌主要通過手術治療，而晚期和轉移性胃癌主要依靠化療，但胃癌的耐藥現(xiàn)象往往導致胃癌化療失敗，因此探討胃癌耐藥機制成為一項重要的研究課題[7-8]。

以往的大量體外實驗研究證實，許多化療藥物均能顯著誘導胃癌細胞系發(fā)生凋亡，但這一結果在內體研究時往往效果并不明顯，因為體內腫瘤微環(huán)境要遠比體外單一的實驗環(huán)境復雜得多，尤其是腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）可能參與了胃癌細胞的耐藥過程[9]。

本課題組構建了微流控芯片細胞三維共培養(yǎng)平臺實現(xiàn)腫瘤相關成纖維細胞與胃癌細胞的非接觸共培養(yǎng)，探討CAFs對胃癌細胞耐藥性的影響。微流控芯片技術構建的實驗室具有微型化、高通量、集成化的優(yōu)勢，能實現(xiàn)腫瘤細胞的三維動態(tài)培養(yǎng)。利用微流控芯片將腫瘤細胞和間質細胞進行共培養(yǎng)，芯片通道與細胞大小相適應，模擬了細胞在體內生長所需的空間；利用微量泵給細胞提供流動培養(yǎng)基，并帶走代謝廢物，更加真實地模擬腫瘤在體內的生存狀態(tài)，構建了體內腫瘤微環(huán)境，是進行腫瘤相關研究的理想模式。

腫瘤間質相關成纖維細胞（CAFs）與創(chuàng)傷修復過程中的成纖維細胞不同，不再向正常表型轉化，而保持持續(xù)活化的特征，并通過產生各種細胞因子促進臨近腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移，促進腫瘤的演進。CAFs和腫瘤細胞之間的相互作用表現(xiàn)在許多方面，它還可能與腫瘤細胞的耐藥性有關，而以往對腫瘤耐藥性的研究多側重于腫瘤細胞本身，但越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤間質成分可能通過各種途徑影響腫瘤細胞的耐藥性。為了驗證CAFs對腫瘤細胞藥物敏感性的影響，筆者把各實驗組細胞用順鉑作用48 h，PI染色后顯微鏡下細胞凋亡情況。結果顯示CAFs+SGC7901共培養(yǎng)組與單培養(yǎng)組相比，SGC7901細胞對順鉑的敏感性較SGC7901細胞單獨培養(yǎng)時低（P<0.05），表明CAFs能降低順鉑對胃癌細胞的敏感性，促進SGC7901細胞對順鉑的耐藥。此前有研究者發(fā)現(xiàn)CAFs與抗血管生成藥的耐藥性的產生有關，能引起腫瘤細胞對西妥昔單抗的耐藥[10-11]。

CAFs可能通過代謝調節(jié)、免疫調節(jié)等途徑促進腫瘤細胞的耐藥。腫瘤細胞由于增殖速度快，必然導致營養(yǎng)相對供應不足，造成局部低氧和酸中毒的微環(huán)境，可誘導葡萄糖調節(jié)蛋白（Glucose regulated proteins，GRPs）的產生[12]，其中GRP78是這種應激性蛋白的代表。它是一種內質網(wǎng)分子伴侶蛋白，許多研究報道GRP78高表達與某些腫瘤細胞耐藥相關[13-15]。本研究用微流控芯片平臺免疫熒光法檢測SGC7901細胞GRP78蛋白表達水平，探討CAFs引起的胃癌細胞對順鉑的耐藥是否能引起與GRP78蛋白表達的改變。結果CAFs與SGC7901細胞共培養(yǎng)組SGC7901細胞中GRP78蛋白表達較對照組升高（P<0.05），因此推斷，CAFs引起的SGC7901細胞對順鉑耐藥與GRP78蛋白的表達有一定相關性。

綜上所述，腫瘤相關成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的宿主細胞，腫瘤微環(huán)境中的CAFs可能通過增加腫瘤細胞中GRP78蛋白的表達而引起胃癌細胞對順鉑的耐藥，微流控芯片構建的腫瘤細胞成纖維細胞共培養(yǎng)體系能真實模擬體內腫瘤微環(huán)境，是研究腫瘤的理想模式。

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（收稿日期：2015-12-09） （本文編輯：歐麗）