楊天偉　劉鴻高　張霽　李濤　王元忠

摘要：建立采用紫外光譜技術(shù)快速鑒別不同產(chǎn)地美味牛肝菌（Boletus edulis）的方法，確定美味牛肝菌最佳提取溶劑和時(shí)間，制備測(cè)試液，應(yīng)用紫外光譜技術(shù)建立7個(gè)不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋和菌柄的紫外指紋圖譜，光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，其最佳提取溶劑為氯仿，提取時(shí)間為30min；在10h內(nèi)的穩(wěn)定。性、方法重現(xiàn)。性和精密度的RSD分別在0.04%～1.73%、0.03%～0.63%、0～2.87%之間，表明該方法穩(wěn)定可靠；菌蓋、菌柄的紫外指紋圖譜出峰位置相似，而峰高具有差異，表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌化學(xué)組分相似，含量存在差異；聚類分析結(jié)果顯示采自同一地區(qū)的美味牛肝菌能夠很好聚類。研究表明，紫外光譜結(jié)合聚類分析能快速鑒別不同產(chǎn)地美味牛肝菌，可作為野生食用菌的鑒別和質(zhì)量控制新方法。

關(guān)鍵詞：紫外光譜；美味牛肝菌（Boletus edulis）；聚類分析；鑒別

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2362-04

食藥用菌是人類食物的重要來(lái)源，營(yíng)養(yǎng)、保健價(jià)值獨(dú)特，是較理想的健康食品之一。美味牛肝菌（Bofetus edulis Bull）又稱大腳菇，其子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、多糖、礦質(zhì)元素等，深受消費(fèi)者的推崇，為著名食用山珍和藥用真菌，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥食同源型真菌。云南特殊的生境資源適宜多種野生菌生長(zhǎng)，美味牛肝菌產(chǎn)量高，分布廣泛。受地理、環(huán)境因素影響，不同產(chǎn)地美味牛肝菌化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、藥效等不盡相同。

傳統(tǒng)的野生食用菌鑒別主要依據(jù)外觀形貌，生長(zhǎng)特性。顯微結(jié)構(gòu)，菌肉、菌管的顏色及變色反應(yīng)等進(jìn)行。同種食用菌在不同生長(zhǎng)環(huán)境下出現(xiàn)大量表形變異，如美味牛肝菌菌蓋顏色有褐色、黃褐色、紅褐色或深褐色，菌管有乳白色、淡褐色。偶爾成黃綠色。其顏色變化較大：不同種類形態(tài)相似性大，不易準(zhǔn)確鑒別。目前，對(duì)食用菌的鑒別分類的研究主要有紅外光譜法和分子生物學(xué)方法，研究者利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法鑒別不同的靈芝產(chǎn)品；根據(jù)不同種類食用菌紅外光譜的峰高、峰形的差異結(jié)合主成分分析、聚類分析等方法鑒別不同產(chǎn)地、不同種類食用菌，但這種方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，難以建立完整的鑒別體系。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為真菌分類學(xué)注入了新的活力，改變和完善了真菌分類的一些概念，魏海龍等設(shè)計(jì)5對(duì)ITS引物并對(duì)ITS區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)牛肝菌屬卷邊組Boletus sect.Appendiculati物種的相互識(shí)別。Mello等根據(jù)ITS片段設(shè)計(jì)引物，對(duì)銅色牛肝菌（Boletus aereus Bull.）、美味牛肝菌等進(jìn)行了分子鑒別：Lian等應(yīng)用ITS設(shè)計(jì)引物辨別美味牛肝菌與其他蘑菇。分子生物學(xué)方法需具備一定學(xué)科知識(shí)背景，儀器操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，其推廣運(yùn)用具有較大局限性。

指紋圖譜是運(yùn)用現(xiàn)代儀器（光譜儀、色譜儀等）檢測(cè)得到的能夠基本反映成分較復(fù)雜物質(zhì)內(nèi)部特征的規(guī)范化圖譜，具有操作簡(jiǎn)便、快速、整體性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種綜合的質(zhì)量控制或物種鑒別方法。指紋圖譜不能代替成分含量測(cè)定，但所獲得的信息比測(cè)定任何單一成分所提供的信息更豐富、更全面，是一種實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品多組分、多指標(biāo)分析的理想方法。紫外指紋圖譜技術(shù)根據(jù)不同物質(zhì)體系紫外吸收?qǐng)D譜的出峰位置、峰高、峰面積等的差異，可用于鑒別不同物質(zhì)體系：該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量控制、中藥材鑒別、酒類鑒別等多個(gè)領(lǐng)域。本研究采用紫外指紋圖譜技術(shù)結(jié)合聚類分析對(duì)采自云南7個(gè)不同地區(qū)美味牛肝菌不同部位的紫外指紋圖譜進(jìn)行鑒別分析，為野生食用菌的鑒別分類提供輔助方法。

1 材料與方法

1.1 材料

美味牛肝菌樣品：采于2011年7月，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉鴻高教授鑒定，來(lái)源地見(jiàn)表1。

主要設(shè)備：UV-2550雙通道紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（配有UVprobe工作站），日本島津制作：K05200型超聲波清洗機(jī)，昆明市超聲儀器有限公司。

主要試劑：氯仿（分析純），西隴化工股份有限公司：石油醚（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司：氫氧化鈉（分析純），西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），云南汕滇藥業(yè)有限公司；蒸餾水，自制。

1.2 樣品處理

樣品采集后。清洗干凈。50℃烘干。每個(gè)來(lái)源地取10個(gè)美味牛肝菌子實(shí)體，菌蓋、菌柄分開(kāi)粉碎，過(guò)100目篩。

1.3 美味牛肝菌特征成分提取條件確定

1.3.1 提取溶劑 以樣品1為考察對(duì)象，確定最佳提取溶劑。準(zhǔn)確稱取0.1000g樣品于25mL比色管中，分別加入10mL蒸餾水、無(wú)水乙醇、石油醚、氯仿、0.5mol/LNaOH，每組分別平行3次；超聲波提取30min。過(guò)濾，以對(duì)應(yīng)的溶劑為參比液，測(cè)定紫外光譜，根據(jù)吸收峰數(shù)確定提取溶劑。

1.3.2 最佳提取時(shí)間 以樣品1為考察對(duì)象，確定最佳提取時(shí)間。準(zhǔn)確稱取0.1000g樣品。加入10mL氯仿，分別超聲波提取20、30、40、50、60min，過(guò)濾，測(cè)定紫外光譜，根據(jù)吸收峰數(shù)確定最佳提取時(shí)間。

1.4紫外光譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱取各樣品0.1000g于25mL比色管中。加入10mL氯仿，超聲波提取30min，過(guò)濾：設(shè)定紫外光譜掃描波長(zhǎng)為190-450nm，狹縫寬度1.0nm，采樣間隔0.2nm，重復(fù)測(cè)定3次。以氯仿作為參比液和測(cè)試液進(jìn)行基線校正及空白測(cè)定：用UV-2550自帶的UVprobe軟件分析3次測(cè)定結(jié)果，扣除空白，以消除溶劑干擾，強(qiáng)化譜帶特征。建立清晰的美味牛肝菌紫外指紋圖譜，

1.5 方法學(xué)試驗(yàn)

以樣品1為考察對(duì)象，考察重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性。稱取0.1000g樣品5份，按“1.4”制備測(cè)試液，經(jīng)190-450nm紫外光譜測(cè)定，計(jì)算不同波長(zhǎng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察重現(xiàn)性。樣品1的氯仿提取液在190-450nm重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算不同吸收波長(zhǎng)的RSD，考察精密度。樣品1的氯仿提取液分別在2、4、6、8、10h時(shí)進(jìn)行紫外光譜測(cè)定，計(jì)算不同吸收波長(zhǎng)的RSD，考察穩(wěn)定性。

1.6數(shù)據(jù)處理

由于190-230nm紫外吸收峰受溶劑和光譜噪音的干擾嚴(yán)重，牛肝菌樣品的紫外光譜特征吸收峰在230-450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，因此取230-450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置后，用SPSS19.0軟件進(jìn)行聚類分析，直觀表征不同產(chǎn)地美味牛肝菌樣品間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 美味牛肝菌樣品的提取條件

2.1.1 最佳提取溶劑 由相同條件下用不同溶劑提取樣品1的紫外指紋圖譜（圖1）可以看出，無(wú)水乙醇、蒸餾水和0.5mol/LNaOH提取液沒(méi)有明顯的紫外吸收峰：石油醚提取液的紫外吸收峰數(shù)目少且吸收峰不明顯：氯仿提取液在260-300Bill波長(zhǎng)范圍內(nèi)有明顯的紫外吸收峰，吸收峰數(shù)目多于其他溶劑提取，確定氯仿為最佳提取溶劑。

2.1.2 最佳提取時(shí)間 以氯仿作為提取溶劑，考察不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可看出超聲波提取時(shí)間為20min時(shí)，美味牛肝菌樣品提取液的紫外吸收峰不明顯：提取時(shí)間為30min時(shí)具有明顯的紫外吸收峰，此后延長(zhǎng)提取時(shí)間，吸收峰數(shù)目沒(méi)有明顯變化，故選30min為最佳提取時(shí)間。

2.2 重現(xiàn)性、精密度和穩(wěn)定性

美味牛肝菌氯仿提取液紫外光譜的重現(xiàn)性變異系數(shù)在0.03%-0.63%之間：精密度變異系數(shù)在0～2.87%之間：10h內(nèi)穩(wěn)定性的變異系數(shù)在0.04%～1.73%之間，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.3 美味牛肝菌菌蓋、菌柄的紫外指紋圖譜

由不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋的紫外指紋圖譜（圖3）可見(jiàn)，不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋主要紫外吸收峰出現(xiàn)的位置基本一致，所有樣品在276、281、295nm等處出現(xiàn)明顯的吸收峰，表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋中化學(xué)組分基本相同：但不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋的吸光度有很大差異，如在281nm處樣品1的吸光度最小，為0.476，樣品5的吸光度最大，為1.105，表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋中化學(xué)成分量有差異。由不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌柄的紫外指紋圖譜（圖4）可見(jiàn)，不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌柄的紫外指紋圖譜與菌蓋紫外指紋圖譜相似，峰形差異較小。而峰高（吸光度）差異較大：表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌柄的化學(xué)組分差異不明顯，而各成分含量不同。

2.4聚類分析

聚類分析是根據(jù)樣品間的相似關(guān)系，將相似性大的樣品聚為一類。從不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋聚類分析的的樹(shù)形圖（圖5）可看出7個(gè)不同產(chǎn)地樣品聚為2大類，樣品1、3、6間的距離及樣品2、4、5間的距離小于5分別聚為一類，表明樣品1、3、6之間及樣品2、4、5之間的化學(xué)組分及含量差異較小；而這兩大類樣品間的距離較大，表明兩類樣品的化學(xué)成分含量差異較大。樣品7與樣品2、4、5聚成一類，表明樣品7與樣品2、4、5的差異較小。根據(jù)樣品來(lái)源信息（表1）可知，距離小于5時(shí)能聚在一起的樣品1、3、6均采自楚雄南華縣，2和4采自具有部分接壤的晉寧縣和易門縣：距離小于10能聚在一起的樣品5和7均采自姚安地區(qū)，表明美味牛肝菌積累的化學(xué)成分及含量與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)。

從不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌柄聚類分析的樹(shù)形圖（圖6）可看出，樣品間距離小于5的7個(gè)不同產(chǎn)地樣品聚為2類，第一類包括樣品1、3、6，第二類包括樣品2、4、5、7，兩類樣品間的距離較大，表明兩類樣品間的化學(xué)組分含量差異較大。與圖5相比，菌蓋和菌柄均能聚為兩大類，但是聚類過(guò)程存在差異，表明美味牛肝菌不同部位對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集能力不同。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋和菌柄的紫外光譜共有峰反映出不同產(chǎn)地美味牛肝菌主要的化學(xué)組分相似，而吸光度的差異反映了不同產(chǎn)地美味牛肝菌對(duì)化學(xué)成分的積累不同，這與Falandysz等研究的不同產(chǎn)地美味牛肝菌對(duì)礦質(zhì)元素積累不同的結(jié)論相符。聚類分析結(jié)果顯示采自地理位置較近區(qū)域的樣品能聚在一起，表明美味牛肝菌的不同成分量與其生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，即土壤環(huán)境、氣候條件等比較相似的地區(qū)美味牛肝菌化學(xué)成分積累較相似，而地質(zhì)地貌、土壤環(huán)境、氣候條件等差異較大的地區(qū)化學(xué)組分和含量差異較大。

應(yīng)用紫外光譜法測(cè)定了7個(gè)不同產(chǎn)地美味牛肝菌菌蓋、菌柄的紫外指紋圖譜，樣品紫外圖譜出峰位置較相似，表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌化學(xué)組分相似：而紫外吸光度大小具有一定的差異，表明不同產(chǎn)地美味牛肝菌化學(xué)成分含量不同。菌蓋、菌柄紫外光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置后進(jìn)行聚類分析，同一產(chǎn)地樣品聚類效果較好，可以根據(jù)美味牛肝菌不同部位（菌蓋、菌柄）的紫外指紋圖譜結(jié)合聚類分析方法快速區(qū)分不同產(chǎn)地的美味牛肝菌。本研究為野生食用菌的鑒別分類提供新思路。