張蕓，段勁峰，陳忠倫，羅倩，文世全 (綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽 621000)

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急性腦梗死患者血清HSP70水平變化及意義

張蕓，段勁峰，陳忠倫，羅倩，文世全 (綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽 621000)

摘要：目的觀察急性腦梗死患者血清熱休克蛋白70(HSP70)水平變化，并探討其意義。方法將61例急性腦梗死患者作為觀察組，30例健康者作為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測觀察組發(fā)病后第1～3天、第7、14、28天及對照組血清HSP70，采用Spearman秩相關(guān)檢驗分析觀察組血清HSP70水平與NIHSS評分、腦梗死體積、Barthel指數(shù)評定量表評分的關(guān)系。結(jié)果與對照組相比，觀察組血清HSP70水平在發(fā)病后第1～3天、第7、14、28天均高(P均<0.05)。觀察組發(fā)病后第1～3天、第7、14和28天血清HSP70水平與NIHSS評分均呈正相關(guān)(r分別為0.365、0.628、0.371、0.608，P均<0.05)，與腦梗死體積均呈正相關(guān)(r分別為0.402、0.437、0.411、0.398，P均<0.05)。觀察組發(fā)病后第7、28天血清HSP70水平與BI評分呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.349、-0.621，P均<0.05)。以6.33 ng/mL為界值，血清HSP70診斷急性腦梗死的靈敏度為73.3%，特異度為96.7%,ROC曲線下面積為0.943 3(P<0.000 1)。結(jié)論急性腦梗死患者血清HSP70水平升高，監(jiān)測血清HSP70水平有助于判斷急性腦梗死病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。

關(guān)鍵詞：熱休克蛋白70；急性腦梗死；神經(jīng)功能缺損；腦梗死體積

熱休克蛋白70(HSP70)是急性腦卒中腦損傷過程中的重要參與者[1,2]，動物實驗研究[3]發(fā)現(xiàn)其在急性腦卒中大鼠腦組織中的表達(dá)量明顯升高，但是關(guān)于HSP70在急性腦卒中患者血清中的表達(dá)情況目前相關(guān)研究較少。本研究觀察了急性腦梗死患者血清HSP70水平變化，并對其在急性腦梗死患者的病情監(jiān)測的臨床意義進(jìn)行探討。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2013年2月～2014年11月在綿陽市中心醫(yī)院接受住院治療的急性腦梗死患者61例(觀察組)，診斷均經(jīng)過CT和MRI確診。觀察組患者為首次發(fā)病，發(fā)病時間到入院時間均<1 d，排除伴有自身免疫性疾病及嚴(yán)重感染的患者，排除使用免疫抑制劑或者免疫增強(qiáng)藥物的患者，排除合并有嚴(yán)重心、肝、腎功能衰竭的患者。另選擇30例同期健康體檢者作為對照組，頭顱CT或MRI檢查無腦梗死、腦出血，無中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、變性、癲癇、腫瘤以及自身免疫性疾病。觀察組男31例、女30例，年齡(74.40±18.50)歲，吸煙18例，BMI(26.0±3.6)kg/m2，高血壓病50例，總膽固醇(4.90±1.12)mmol/L，LDL(3.02±0.91)mmol/L，HDL(1.22±0.27)mmol/L，甘油三酯0.75～1.72 mmol/L，肌酐(1.0±0.3)mmol/L，腦梗死面積(27.4±46.6)cm3。對照組男16例、女14例，年齡(74.70±4.46)歲，吸煙10例，BMI(26.2±3.4)kg/m2，高血壓病24例，總膽固醇(5.15±0.88)mmol/L，LDL(2.89±0.78)mmol/L，HDL(1.47±0.28)mmol/L，甘油三酯0.94～1.58 mmol/L，肌酐(0.88±0.20)mmol/L。兩組一般資料具有可比性。本研究均經(jīng)患者或其家屬知情同意，研究方案經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2血清HSP70檢測觀察組分別于發(fā)病后第1～3天、第7、14和28天按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)[4]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分，用Barthel指數(shù)評定量表(BI)[5]評估患者日常生活能力，觀察腦梗死體積。觀察組進(jìn)行評分的同時采集患者的肘靜脈血10 mL，裝入加EDTA的離心管中，對照組于晨起空腹靜脈抽血10 mL，3 000 r/min離心10 min，將分離的血清置于-80 ℃冰箱中保存待檢。HSP70酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，檢測操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。測量前首先將試劑盒及樣本平衡至室溫，采用標(biāo)本稀釋液按1∶1將待測標(biāo)本稀釋，吸取50 μL稀釋后標(biāo)本加入反應(yīng)孔內(nèi)，然后加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔混勻，立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h；甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。然后每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血漿樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度。

2結(jié)果

兩組血清HSP70水平比較見表1。觀察組發(fā)病后第1～3天、第7、14和28天血清HSP70水平與NIHSS評分均呈正相關(guān)(r分別為0.365、0.628、0.371、0.608，P均<0.05)，與腦梗死體積均呈正相關(guān)(r分別為0.402、0.437、0.411、0.398，P均<0.05)。觀察組發(fā)病后第7、28天血清HSP70水平與BI評分呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.349、-0.621，P均<0.05)。采用ROC曲線分析觀察組發(fā)病后第1～3天血清HSP70水平發(fā)現(xiàn)，以6.33 ng/mL為界值，血清HSP70診斷急性腦梗死的靈敏度為73.3%，特異度為96.7%,ROC曲線下面積為0.9433(P<0.000 1)。

表1　兩組發(fā)病后血清HSP70水平比較

注：與對照組相比，*P<0.01。

3討論

HSP70的分子量約為70 kDa，主要由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：一個結(jié)構(gòu)域是富含碳的肽鏈的結(jié)合位點(diǎn)，另外一個結(jié)構(gòu)域是ATP的結(jié)合位點(diǎn)，這個位點(diǎn)可以同時控制ATP的結(jié)合過程。在正常情況下，HSP70主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，HSP70在應(yīng)激和細(xì)胞外刺激等作用下迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并且包圍核仁，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激消除后，HSP70從細(xì)胞核內(nèi)返回到細(xì)胞質(zhì)[6]。分子伴侶功能是HSP70在細(xì)胞中執(zhí)行的最基本的生理功能，主要通過與新生、未折疊、聚集或者錯誤折疊的蛋白質(zhì)相結(jié)合，減少不溶性聚集物的產(chǎn)生，促進(jìn)正確的肽鏈折疊，促進(jìn)某些變性蛋白的降解和清除。此外，HSP70還可以發(fā)揮抗凋亡作用，主要與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。HSP70可以提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性[7]。HSP70在損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織內(nèi)表達(dá)量顯著升高，使用外源性的藥物進(jìn)一步誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，可以在氧化應(yīng)激、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病中發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，缺失HSP70蛋白則加重腦損傷的程度[8,9]，在急性腦梗死動物模型中使用HSP70的誘導(dǎo)劑可以發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[9～11]，可見，HSP70在中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷性疾病中可以發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，HSP70不僅在損傷的神經(jīng)組織內(nèi)表達(dá)，其在腦外傷患者的血清中也存在高表達(dá)，并與患者病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明早期檢測HSP70的表達(dá)對于判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病情輕重具有重要的意義。

以往對于腦卒中患者血清中HSP70的表達(dá)尚缺乏相關(guān)研究。本研究結(jié)果表明，急性腦梗死患者血清HSP70水平在發(fā)病后第1～3天的表達(dá)水平顯著高于對照組，之后呈現(xiàn)下降趨勢，這與急性腦梗死后腦組織內(nèi)HSP70的表達(dá)現(xiàn)象具有一致性[12]，提示HSP70可能首先由神經(jīng)細(xì)胞合成，然后通過破壞的血-腦屏障釋放入血。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者血清HSP70的表達(dá)水平亦與腦梗死體積存在正相關(guān)，提示早期檢測血清HSP70水平對于判斷急性腦梗死患者的病情嚴(yán)重程度具有一定的意義；血清HSP70水平與患者的神經(jīng)功能預(yù)后同樣存在顯著相關(guān)性，提示早期檢測血清HSP70水平可能有助于判斷急性腦梗死患者的預(yù)后。ROC曲線分析結(jié)果表明HSP70對急性腦梗死患者的早期診斷具有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，急性腦梗死患者血清HSP70水平升高，血清HSP70水平有助于判斷急性腦梗死病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。然而，由于本研究樣本量有限，且是單中心的研究，血清HSP70水平能否作為急性腦梗死損傷嚴(yán)重程度和預(yù)后判斷的指標(biāo)，還需要以后大樣本、多中心的研究進(jìn)一步去證實。

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(收稿日期：2015-09-20)

中圖分類號：R743.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)11-0065-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.025

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(130443，130446)。