郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

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不同凍存液對(duì)無血清BHK21細(xì)胞冷凍效果的影響

郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛用于科學(xué)研究領(lǐng)域的今天，細(xì)胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇這一基礎(chǔ)技術(shù)日益得到重視。冷凍保存是細(xì)胞長(zhǎng)期保存的唯一方法，有利于減少細(xì)胞被微生物污染和細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性，減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變以及避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。大多數(shù)的細(xì)胞若無特別的要求，都可冷凍保存于-130℃以下長(zhǎng)達(dá)多年。動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存，為細(xì)胞培養(yǎng)工作帶來很大的機(jī)動(dòng)靈活性，降低了人力和物力的消耗。但是細(xì)胞經(jīng)冷凍以后，復(fù)蘇后的活力始終是細(xì)胞工作者最關(guān)心的問題之一，怎么樣才能保證細(xì)胞在凍存的過程中受到的損傷最?。吭趺礃硬拍苁辜?xì)胞復(fù)蘇后的活力以及細(xì)胞形態(tài)與冷凍之前的差異最??？這一直是我們努力的方向。近年來，培養(yǎng)基的發(fā)展很迅速，從正常血清到低血清的培養(yǎng)基，現(xiàn)在已經(jīng)推出了無血清培養(yǎng)基甚至是CD培養(yǎng)基，相應(yīng)就會(huì)有低血清細(xì)胞，以及無血清細(xì)胞。血清在細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中起到了很重要的作用，有很多未知的成分對(duì)細(xì)胞有重要的影響。而體外培養(yǎng)的細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中，非常脆弱，對(duì)各種因素十分敏感，那么在無血清細(xì)胞的凍存過程中，怎樣能保證細(xì)胞的最高活力，這是一個(gè)新的課題。有很多的因素會(huì)影響解凍后的細(xì)胞的存活率，例如細(xì)胞的冷凍密度、凍存液的配方以及冷凍程序，細(xì)胞的解凍溫度等都會(huì)對(duì)細(xì)胞的凍存效果有影響。本實(shí)驗(yàn)就凍存液的配方對(duì)無血清BHK21細(xì)胞活力的影響做了分析，這將會(huì)在生產(chǎn)中有一定的指導(dǎo)意義。

一、材料

1.細(xì)胞株。BHK21細(xì)胞來自金宇保靈生物藥品有限公司。

2.試劑。培養(yǎng)液購(gòu)自CIBCO公司；新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司；甲基纖維素購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自SIGMA公司；DMSO （D2650）購(gòu)自SIGMA-ALDRJCH 公司。

3.其它實(shí)驗(yàn)器材和儀器。超凈工作臺(tái)(YJ-1450)購(gòu)自吳江市江南凈化工程有限公司；離心機(jī)（DL-5-B）購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；冰箱（SC-276）購(gòu)自青島海爾電冰柜有限公司；倒置顯微鏡（CKX41）OLYMPUS；液氮罐（YDS-30-125F）購(gòu)自樂山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司；50 ml離心管，凍存管購(gòu)自corning公司；移液器購(gòu)自芬蘭雷伯；鑷子、防凍手套、防護(hù)面罩、血球計(jì)數(shù)板、經(jīng)校驗(yàn)的溫度計(jì)均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

二、方法

用對(duì)照、實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2三種不同的凍存液凍存同一批細(xì)胞，在細(xì)胞凍存半年后同時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇，每種凍存的細(xì)胞復(fù)蘇2支，檢驗(yàn)凍存效果，計(jì)算復(fù)蘇活力。重復(fù)進(jìn)行三次凍存實(shí)驗(yàn)。

1.凍存液的配制。對(duì)照凍存液：7.5％ DMSO，92.5％培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)1凍存液：7.5％ DMSO，10％血清，82.5％培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)2凍存液：7.5％ DMSO，10％甲基纖維素，82.5％培養(yǎng)液。

2.細(xì)胞的離心。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒入離心管中離心900 r/m，5 min。

3.細(xì)胞的分裝及凍存。細(xì)胞離心后，棄上清，用已經(jīng)配制好的3種凍存液重懸細(xì)胞，然后分裝入凍存管中，每管1.5 ml。按以下程序進(jìn)行凍存：4℃放置1 h，-20℃放置2 h，液氮口放置0.5 h，放入液氮中。

4.細(xì)胞復(fù)蘇。細(xì)胞凍存半年后進(jìn)行復(fù)蘇，每種細(xì)胞復(fù)蘇2支，計(jì)算其平均活力。從液氮中取出凍存管直接放入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)使其在1～2 min內(nèi)盡快融化。融化后離心720 r/m，5 min，棄上清，每支管中加入1 ml培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，計(jì)算其活力。細(xì)胞計(jì)數(shù)：4大格細(xì)胞總數(shù)÷4×104×稀釋倍數(shù)。細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100％。

三、結(jié)果與分析

1.凍存前細(xì)胞的密度和活力。結(jié)果見表1，三次試驗(yàn)的細(xì)胞的活力都在95％以上，符合凍存標(biāo)準(zhǔn)。

表1　凍存前細(xì)胞的密度和活力

2.復(fù)蘇后細(xì)胞的密度和活力。結(jié)果見表2。

表2　復(fù)蘇后細(xì)胞的密度和活力

表2結(jié)果顯示，共進(jìn)行了三次凍存實(shí)驗(yàn)，從復(fù)蘇活力的平均值來看，對(duì)照的復(fù)蘇活力三次都是最低的，其中的1次低于90％，而實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2的復(fù)蘇活力均比對(duì)照的高，均在90％以上，而且實(shí)驗(yàn)1的復(fù)蘇活力是最高的。

四、討論

細(xì)胞凍存在細(xì)胞培養(yǎng)中是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，細(xì)胞凍存效果的好壞直接影響細(xì)胞復(fù)蘇后的成活率以及后期的繁殖。尤其是對(duì)于無血清BHK21細(xì)胞的凍存，無血清的細(xì)胞非常脆弱，很容易受到外界因素的影響。本文就不同配方的凍存液來凍存無血清BHK21細(xì)胞，復(fù)蘇后檢驗(yàn)其復(fù)蘇活力，進(jìn)行了三次平行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，含有血清和甲基纖維素的凍存液凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后的復(fù)蘇活力比對(duì)照高?？赡苁怯捎谠诩?xì)胞的凍存過程中，血清和甲基纖維素起到了一定的保護(hù)作用，減少了細(xì)胞在凍存過程中受到的損傷，因此表現(xiàn)出細(xì)胞的復(fù)蘇活力高。因此建議在無血清BHK21細(xì)胞的凍存中，凍存液中最好添加血清或甲基纖維素，以提高保護(hù)性能。

在本實(shí)驗(yàn)中，涉及到了很多需要細(xì)胞計(jì)數(shù)的工作，但是實(shí)驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)都是人工計(jì)數(shù)得出，可能存在人為誤差，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，但是由于數(shù)據(jù)都是由固定的人員來做的，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，需要以后繼續(xù)開展實(shí)驗(yàn)，累積數(shù)據(jù)。

五、小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)比較分析了3種不同配方的凍存液對(duì)無血清BHK21細(xì)胞凍存效果的影響，發(fā)現(xiàn)添加血清的凍存液在細(xì)胞凍存的過程中比其它2種凍存液有更好的保護(hù)效果。

參考文獻(xiàn)(略)

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