曲　黎，魏燕麗，范淑敏

(河南科技學(xué)院 新科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

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納米金比色法測(cè)定多西環(huán)素和土霉素

曲黎，魏燕麗，范淑敏*

(河南科技學(xué)院 新科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

摘要：采用檸檬酸鈉還原法合成粒徑約13 nm的納米金粒子. 采用紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)研究了納米金粒子與多西環(huán)素/土霉素分子的相互作用；通過改變緩沖溶液、納米金粒子用量、反應(yīng)時(shí)間確定了比色法測(cè)定的最優(yōu)反應(yīng)條件. 結(jié)果表明：在弱酸溶液中，多西環(huán)素/土霉素分子中的氨基官能團(tuán)(-NH2)得到電子成為帶電基團(tuán)(-NH3+) 并通過靜電引力與納米金粒子結(jié)合，使得納米金粒子發(fā)生聚集，導(dǎo)致納米金吸收光譜發(fā)生紅移和展寬，顏色由酒紅色變成藍(lán)色；在鹽酸-檸檬酸鈉的緩沖溶液中加入2 mL納米金，反應(yīng)時(shí)間為10 min的條件下測(cè)得多西環(huán)素和土霉素的線性范圍分別為0.06～0.66 mg·L(-1)和0.59～8.85 mg·L(-1)，檢出限(3σ)分別為0.008 6、0.083 8 mg·L(-1). 該方法前處理簡單、靈敏、可靠，有望應(yīng)用于食品分析和臨床分析等領(lǐng)域.

關(guān)鍵詞：納米金粒子；比色法；多西環(huán)素；土霉素

四環(huán)素類抗生素(tetracycline antibiotics)是含有并四苯基本骨架的一類廣譜抗生素[1-3]. 土霉素和多西環(huán)素都可以促進(jìn)畜禽的生長，預(yù)防和治療畜禽、魚類的疾病，并可以增加產(chǎn)奶量. 過量使用土霉素和多西環(huán)素造成動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留，影響人體健康，因此對(duì)動(dòng)物源性食品中土霉素和多西環(huán)素的最高殘留，各個(gè)國家都有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法[4-6]. 目前，我國對(duì)于土霉素和多西環(huán)素的測(cè)定，常用的方法有高效液相色譜法(HPLC)、紫外分光光度法[7]、電化學(xué)分析法[8-10]、熒光法[11-12]和細(xì)菌抑制法[13]等.

納米金比色法靈敏度高，簡單、快速，是目前研究比較熱門的分析測(cè)定方法. 納米金比色分析的主要優(yōu)勢(shì)是通過肉眼即可觀察其顏色變化，簡單快速，而且省去昂貴復(fù)雜的儀器，另外納米金的消光系數(shù)高，靈敏度高，因而比色分析被用于蛋白質(zhì)，DNA，金屬離子和小分子等多種物質(zhì)的檢測(cè)，同時(shí)被用于蛋白質(zhì)之間、DNA之間的相互作用研究[14-16]. 目前，納米金比色法已成功用于三聚氰胺、瘦肉精等物質(zhì)的檢測(cè)[17]. 本文采用納米金比色法測(cè)定土霉素和多西環(huán)素，測(cè)定結(jié)果與藥典分析結(jié)果一致. 此方法簡單，測(cè)定速度快，而且不需要昂貴的儀器及大量的分析試劑，在食品分析及環(huán)境監(jiān)測(cè)方面有很好的應(yīng)用前景.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

PHS-3C酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)；U-3010紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；F-7000熒光分光光度計(jì)(日本日立)； FA1204B電子分析天平(上海佑科儀器有限公司)；CL-2恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；Tecnai G2 20s-twin高分辨型透射電子顯微鏡(日本).

四氯金酸(Sigma-Aldrich 公司)；多西環(huán)素，土霉素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；鹽酸-乙酸鈉緩沖溶液、鹽酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；多西環(huán)素片劑(0.1 g，國藥準(zhǔn)字H13021945)和注射液(0.1 g，國藥準(zhǔn)字p0060405)為藥店隨機(jī)購買；二次蒸餾水、超純水由實(shí)驗(yàn)室提供，所用試劑均為分析純.

1.2納米金的合成[5]

用新配制的王水浸泡所用玻璃器皿24 h，超純水洗后烘干備用. 將氯金酸配成1%的溶液，精確量取1 mL于100 mL棕色容量瓶中稀釋至0.01%. 將0.01%的氯金酸溶液攪拌加熱至沸后加入2.75 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，12 min后顏色由紫紅色變?yōu)榫萍t色，冷卻至室溫，用0.2 μm超濾膜過濾，濾液于棕色試劑瓶中4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3測(cè)定吸光度

取2.5 mL新制納米金于5 mL容量瓶中，加入鹽酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，定容. 取2 mL納米金，依次加入不同體積的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.50×10-4g·mL-1)/土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.48×10-3g·mL-1)，混合均勻，以水為參比分別測(cè)定吸光度.

2結(jié)果與討論

2.1納米金表征

納米金呈酒紅色，其表觀顏色及粒徑與文獻(xiàn)報(bào)道一致. 球形納米金粒子存在表面等離子吸收的特征峰，以水為空白，繪制納米金吸收曲線，如圖1所示，在518 nm處有最大吸收，據(jù)此可計(jì)算納米金的粒徑，約為13 nm[18]. 由納米金的紫外可見吸收光譜圖可以看出納米金顆粒穩(wěn)定，符合分析要求.

圖1　納米金的紫外-可見吸收光譜Fig.1　Absorption spectra of GNPs

納米金的透射電鏡分析(TEM)如圖2所示，制備的納米金為球形，粒徑均勻，分散良好.

圖2　納米金的透射電鏡圖Fig.2　SEM of GNPs

2.2多西環(huán)素/土霉素測(cè)定原理

實(shí)驗(yàn)利用檸檬酸鈉還原氯金酸制備納米金，納米金粒子表面包裹大量的檸檬酸根離子，由于靜電排斥力納米金不發(fā)生凝聚. 在弱酸溶液中，多西環(huán)素/土霉素分子中的氨基官能團(tuán)(-NH2)可以得到電子(-NH3+)，和納米金粒子之間通過靜電引力相互作用，引發(fā)納米金凝聚. 凝聚后的納米金透射電鏡圖如圖3所示，納米金凝聚在一起，證明了納米金粒子與四環(huán)素類抗生素之間的相互作用. 凝聚后納米金顏色由酒紅色變?yōu)樽仙罱K變?yōu)樗{(lán)色，由于納米金表面等離子共振，其吸收光譜發(fā)生紅移和展寬，紫外-可見吸收光譜如圖4，納米金的最大吸收峰由原來的518 nm紅移至640 nm. 納米金的共振散射光譜如圖5所示，納米金凝聚后，共振散射光譜增強(qiáng). 并且在一定范圍內(nèi)納米金的聚集與多西環(huán)素/土霉素的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，據(jù)此可建立簡單、快速測(cè)定多西環(huán)素/土霉素的比色分析.

多西環(huán)素0.54 mg·L-1圖3　凝聚后的納米金透射電鏡圖Fig.3　SEM of GNPs in the presence of doxycycline

(a)不存在多西環(huán)素(b)存在0.54 mg·L-1多西環(huán)素圖4　納米金的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4　UV-Vis absorption spectra of GNPs

(a)不存在多西環(huán)素(b)存在0.48 mg·L-1多西環(huán)素圖5　納米金的共振散射光譜圖Fig.5　RRS spectra of GNPs

2.3實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

將多西環(huán)素加入納米金后，納米金產(chǎn)生凝聚，其凝聚程度可用Δ(A640/A518)來表示. 在pp.0～7.0范圍考查緩沖溶液對(duì)測(cè)定的影響. 圖6顯示不同緩沖溶液對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果表明使用鹽酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的測(cè)定效果較好. 圖7顯示緩沖溶液加入量對(duì)測(cè)定的影響，700 μL pH為2.1的鹽酸-檸檬酸鈉緩沖溶液引起納米金凝聚的Δ(A640/A518)值最大. 其原因是pH 過低時(shí)，納米金粒子表面所帶負(fù)電荷較少, 不利于結(jié)合多西環(huán)素, 而pH 過高, 多西環(huán)素中質(zhì)子化的氫解離, 使正電荷減少,也不利于結(jié)合.

圖6　緩沖溶液對(duì)Δ(A640/A518)的影響Fig.6　Effect of acidity on determination of doxycycline by using different buffer solutions

圖7　鹽酸-檸檬酸鈉加入量對(duì)Δ(A640/A518)的影響Fig.7　Effect of addition of HCl-sodium citrate buffer solution

同時(shí)我們也考察了納米金的用量對(duì)體系測(cè)定的影響. 改變納米金的用量從1～3 mL，不同納米金用量對(duì)應(yīng)的Δ(A640/A518)值如圖8所示，納米金的濃度增大時(shí)，其最大吸收峰值降低，當(dāng)納米金濃度高時(shí)，對(duì)儀器的染色比較嚴(yán)重，且對(duì)低濃度的多西環(huán)素變化不靈敏，當(dāng)納米金濃度低時(shí)，顏色變化不靈敏，因此實(shí)驗(yàn)選擇2 mL納米金.

圖9考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響，連續(xù)測(cè)定1 h，結(jié)果表明:加入多西環(huán)素，10 min凝聚程度最大，10 min后基本不再變化，反應(yīng)時(shí)間設(shè)為10 min.

圖8　不同納米金用量對(duì)應(yīng)的Δ(A640/A518)Fig.8　Effect of addition of GNPs on Δ(A640/A518)

圖9　反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸收光譜的影響Fig.9　Effect of reaction time on Δ(A640/A518)

2.4多西環(huán)素/土霉素的測(cè)定

在最優(yōu)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法依次加入多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液并測(cè)定其吸收光譜(圖10)，由Δ(A640/A518)對(duì)多西環(huán)素的濃度作圖(如圖10所示)，線性范圍為0.06～0.66 mg·L-1，線性回歸方程為Δ(A640/A518)= 0.042+ 1.480 4c(多西環(huán)素，mg·L-1),相關(guān)系數(shù)為0.998，檢出限(3σ)為0.008 6 mg·L-1,納米金比色法測(cè)定多西環(huán)素具有檢出限低，靈敏度高，方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于食品分析領(lǐng)域.

最優(yōu)條件下測(cè)定土霉素，測(cè)定其吸收光譜(圖11)，在0.59～8.85 mg·L-1范圍內(nèi)，線性回歸方程為Δ(A630/A518) = 0.222 + 0.077c(土霉素，mg·L-1),相關(guān)系數(shù)0.999，檢出限(3σ)0.083 8 mg·L-1.

a→g: 0, 0.06, 0.12, 0.3, 0.42, 0.54, 0.66 mg·L-1.圖10　不同濃度多西環(huán)素存在下納米金的紫外-可見吸收光譜圖及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10　UV-Vis absorption spectra of GNPs in the absence and presence of doxycycline

2.5常見物質(zhì)的干擾

表1考察了金屬離子、氨基酸及結(jié)構(gòu)類似藥物的干擾. 結(jié)果表明，對(duì)于0.54 mg·L-1多西環(huán)素，該體系基本不受干擾，有較好選擇性.

2.6回收率

取多西環(huán)素20片，研細(xì), 精密稱取約一片多西環(huán)素質(zhì)量，鹽酸溶解后過濾，移至容量瓶，定容. 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，精密量取適量樣品溶液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0.06、0.54 mg·L-1，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

a→h: 0, 0.59, 1.77, 4.13, 6.49, 7.39, 8.26, 8.85 mg·L-1.圖11　納米金與土霉素相互作用的紫外-可見吸收光譜圖及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11　UV-Vis absorption spectra of GNPs in the absence and presence of oxytetracycline

CoexistingsubstanceMultipleamountadded/(mg·L-1)RelativeDeviation/%CoexistingsubstanceMultipleamountadded/(mg·L-1)RelativeDeviation/%CuSO4MgSO4CaCl2Fe(NO3)3NaClKClNH4ClMnCl2Ba(NO3)2L-leucine6.99127.78257.498.7361.128.047.251.9723.90102.02-0.861.40-2.604.500.814.704.904.18-0.291.10L-valineL-prolineL-threonineL-serineGSHGlucoseVcVb1Vb12193.9381.29143.47504.122.04904.692.66166.932.022.301.903.501.061.431.303.023.704.32

精密量取1 mL多西環(huán)素注射液于棕色容量瓶中，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，精密量取適量樣品溶液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0.12、0.42 mg·L-1，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2.

2.7含量測(cè)定

精密量取多西環(huán)素片劑及注射液樣品，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，結(jié)果見表3. 測(cè)定結(jié)果表明所購多西環(huán)素片劑及注射液含量在標(biāo)示范圍95.0%～105%內(nèi),RSD較小, 符合藥品質(zhì)量管理規(guī)定.

表2　多西環(huán)素片劑及注射液中多西環(huán)素的回收率測(cè)定(n=5)

表3　多西環(huán)素片劑及注射液中多西環(huán)素的測(cè)定(n=3)

3結(jié)論

采用檸檬酸鈉還原氯金酸方法得到納米金. 在弱酸環(huán)境中納米金可與多西環(huán)素、土霉素相互作用，產(chǎn)生凝聚，其吸收光譜發(fā)生紅移，據(jù)此測(cè)定多西環(huán)素、土霉素. 優(yōu)化了緩沖溶液、納米金用量及反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件；在最佳條件下，測(cè)定結(jié)果令人滿意. 同時(shí)分析了多西環(huán)素片劑及注射液，結(jié)果與藥典方法結(jié)果一致. 該方法簡單快速，且不需昂貴儀器及大量分析試劑，在食品及環(huán)境分析方面前景廣泛.

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

Highly sensitive colorimetric detection on doxycycline and oxytetracycline based on gold nanoparticles

QU Li, WEI Yanli, FAN Shumin*

(XinkeCollege,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,Henan,China)

Abstract:The well-dispersed gold nanoparticles (GNPs) were synthesized through sodium citrate reduction method. UV-Vis spectrometer and fluorescence spectrophotometer were used to investigate the mutual effect between GNPs and doxycycline/oxytetracycline. The experimental parameters were optimized with regard to pH, incubation time and concentration of the GNPs. The amino group, which is positively charged in weakly acidic medium (namely, -NH3+), integrates with the negative charge on the surface of gold nanoparticles to form a bigger binding product through electrostatic binding, resulting the aggregation of GNPs with a red-to-purple-to-blue color change. The absorption band of GNPs had a red shift and broadened. Under optimal experimental conditions, the linear ranges of the colorimetric sensor were 0.06-0.66 mg·L(-1) and 0.59-8.85 mg·L(-1) with the corresponding limit of detection (3σ) of 0.008 6 and 0.083 8 mg·L(-1) for doxycycline and oxytetracycline respectively. This method is promising for foods and clinical analysis owing to to its simple, reliable, convenient and low-cost.

Keywords:GNPs; colorimetric method; doxycycline; oxytetracycline

文章編號(hào)：1008-1011(2016)02-0189-06

中圖分類號(hào)：O652.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：曲黎(1981-)，女，講師，研究方向分析化學(xué). 通訊聯(lián)系人，E-mail: fsmhn@aliyun.com.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(51304064).

收稿日期：2016-01-22.