穆晶 趙丹 劉子臣 車南穎 張海青

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·論著·

熒光定量PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本檢測中的應(yīng)用價(jià)值

穆晶 趙丹 劉子臣 車南穎 張海青

目的 探討熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本病理診斷及鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 搜集2014年10月至2015年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院病理科診斷形態(tài)學(xué)符合結(jié)核的93例患者的石蠟包埋標(biāo)本， 12例骨腫瘤患者的石蠟包埋標(biāo)本。所有標(biāo)本以FQ-PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，以抗酸染色法查找抗酸桿菌。以卡方檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，比較FQ-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)抗酸染色法在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的敏感度和特異度；觀察不同發(fā)病部位與兩種技術(shù)檢測陽性率之間的相關(guān)性；以PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)7例結(jié)核分枝桿菌DNA陰性而抗酸染色陽性患者進(jìn)行非結(jié)核分枝桿菌檢測。結(jié)果 所有93例骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本中FQ-PCR技術(shù)檢測陽性77例，敏感度82.8%；抗酸染色查到抗酸桿菌64例，敏感度68.8%。FQ-PCR技術(shù)檢測敏感度明顯高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。在不同發(fā)病部位FQ-PCR技術(shù)敏感度均高于抗酸染色法：在脊柱病變FQ-PCR技術(shù)和抗酸染色法陽性率分別為84.0%(42/50)和64.0%(32/50)(χ2=0.009，P=0.609)；在外周骨關(guān)節(jié)病變FQ-PCR技術(shù)和抗酸染色法陽性率分別為81.4%(35/43)和74.4%(32/43)(χ2=12.609，P=0.002)。PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測確定戈登分枝桿菌1例。結(jié)論 FQ-PCR技術(shù)較抗酸染色法顯著提高了結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率，并為進(jìn)一步檢測非結(jié)核分枝桿菌做出重要提示，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本檢測中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)核，分枝桿菌； 結(jié)核，骨關(guān)節(jié)； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 抗酸染色

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是除淋巴結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎外最常見的肺外結(jié)核，約占結(jié)核病患者的1%～3%[1]，是危害人們健康的嚴(yán)重感染性疾病。骨關(guān)節(jié)結(jié)核致殘率非常高，嚴(yán)重影響人們的健康、工作和生活。在常規(guī)病理診斷中，要確診結(jié)核病，除了要觀察到以肉芽腫伴干酪樣壞死為特征的病理組織學(xué)改變外，還需找到結(jié)核分枝桿菌作為病原學(xué)支持?？顾崛旧?acid-fast staining)尋找結(jié)核分枝桿菌是病理科最普遍、最常用的方法[2]，但該方法存在敏感度低、特異度差、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等不足[3-4]。近年來，從石蠟組織中提取總DNA，應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)檢測石蠟組織中結(jié)核分枝桿菌的特異基因，越來越受到重視。多項(xiàng)研究表明，該技術(shù)在肺結(jié)核組織及淋巴結(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本中的檢測敏感度較常規(guī)抗酸染色有很大提高[5-6]，但在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本中的檢測效率的研究比較少。因此，本研究納入了病理組織學(xué)形態(tài)符合結(jié)核的93例骨關(guān)節(jié)病變患者，應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，探討其在骨關(guān)節(jié)結(jié)核病理診斷及鑒別診斷中的意義。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

搜集2014年10月至2015年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院病理科連續(xù)送檢的骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶清除組織，將病理組織形態(tài)為慢性肉芽腫性炎伴壞死(圖1)，診斷為“結(jié)核”或“符合結(jié)核”的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者93例列為研究對(duì)象。其中男58例，女35例，年齡范圍1～83歲，平均年齡(40.14±19.65)歲，其中1～歲8例(8.6%)，15～歲75例(80.6%)，≥65歲10例(10.8%)。根據(jù)病變發(fā)生部位不同，分為脊柱病變和外周骨關(guān)節(jié)病變，其中脊柱病變50例(53.8%)：腰椎24例(25.8%)、胸椎13例(14.0%)、胸腰椎6例(6.5%)、腰骶椎5例(5.4%)、頸胸椎2例(2.2%)；外周骨關(guān)節(jié)病變43例(46.2%)：膝關(guān)節(jié)8例(8.6%)、髖關(guān)節(jié)7例(7.5%)、足部(踝關(guān)節(jié)，跟骨)7例(7.5%)、肘關(guān)節(jié)5例(5.4%)、腕關(guān)節(jié)4例(4.3%)、肩關(guān)節(jié)3例(3.2%)、骶髂關(guān)節(jié)3例(3.2%)、指骨3例(3.2%)、胸壁2例(2.2%)、恥骨1例1.1%。選取同期骨腫瘤患者12例，其中漿細(xì)胞性骨髓瘤6例，骨巨細(xì)胞瘤3例，骨淋巴瘤3例。對(duì)93例患者石蠟包埋標(biāo)本和12例骨腫瘤患者的標(biāo)本進(jìn)行FQ-PCR檢測。

圖1 脊柱病灶組織呈肉芽腫性炎伴壞死、死骨、出血 (HE ×200)

二、 實(shí)驗(yàn)方法

1. 標(biāo)本處理：所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

2. 抗酸染色：抗酸染色試劑盒(BA-4090B)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司?？顾崛旧菏炃衅? μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇(高濃度到低濃度)后入水；石碳酸復(fù)紅染色1 h，水洗后鹽酸乙醇分化數(shù)秒至無紅色，再水洗；亞甲藍(lán)染色20 s，水洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性膠封片，油鏡下觀察。結(jié)果判定：觀察見到紅色桿狀、略彎曲、串珠狀抗酸桿菌為抗酸染色陽性(圖2)。

圖2 抗酸染色見紅色桿狀、略彎曲抗酸桿菌(油鏡 ×1000)

3. FQ-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌：石蠟包埋組織標(biāo)本的DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)，DNA提取按照試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。結(jié)核分枝桿菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法，Z-RD-0060-02)購自上海之江生物科技股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國羅氏公司的Cobas Z 480。PCR擴(kuò)增體系總體積40 μl：TB PCR反應(yīng)液36 μl，Taq酶0.4 μl，模板4 μl。將處理過的標(biāo)本、陽性和陰性質(zhì)控品分別吸取4 μl加入配制好的PCR體系中。PCR反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min；再按93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，然后使用熒光定量PCR儀檢測；熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為羧基熒光素(FAM)，熒光信號(hào)收集設(shè)置在60 ℃。按照試劑盒說明書分析結(jié)果，出現(xiàn)典型S形擴(kuò)增曲線為陽性。

4. PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測非結(jié)核分枝桿菌：分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法，M20141001)購自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。PCR擴(kuò)增體系總體積25 μl：PCR反應(yīng)管內(nèi)(含反應(yīng)液)加入待測樣品4 μl，同時(shí)取2個(gè)PCR反應(yīng)管，分別加入陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控DNA。PCR反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；再按95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；68 ℃10 min。依次雜交，洗膜，顯色。根據(jù)膜條上探針位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果判讀。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. FQ-PCR法與抗酸染色法與臨床特征的關(guān)系：本組患者中男58例，占62.4%，女35例，占37.6%； 15～歲患者占80.6%(75/93)；脊柱是骨關(guān)節(jié)結(jié)核的最高發(fā)部位，占53.8%(50/93)，其次為膝關(guān)節(jié)8.6%(8/93)?？顾崛旧癋Q-PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度在不同性別、年齡及不同病變部位組患者的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2. FQ-PCR法與抗酸染色法的比較分析：93例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，77例FQ-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌特異基因序列呈陽性，敏感度82.8%；64例抗酸染色查到抗酸桿菌，敏感度68.8%，F(xiàn)Q-PCR法敏感度明顯高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。12例骨腫瘤標(biāo)本的FQ-PCR檢測和抗酸染色均為陰性，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)特異度和抗酸染色法的特異度均為12/12。

3. FQ-PCR法與抗酸染色法在不同病變部位敏感度比較：50例脊柱病變中32例抗酸染色陽性，陽性率64.0%；42例FQ-PCR檢測呈陽性，陽性率84.0%。43例外周骨關(guān)節(jié)患者中32例查到抗酸桿菌，陽性率74.4%；35例FQ-PCR檢測陽性，陽性率81.4%。FQ-PCR在脊柱標(biāo)本和外周骨關(guān)節(jié)標(biāo)本的陽性檢出率均高于抗酸染色法，并且在外周骨關(guān)節(jié)標(biāo)本中FQ-PCR技術(shù)陽性率與抗酸染色法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.609，P=0.002)(表1)。

表1 不同性別、年齡和病變部位骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者標(biāo)本的抗酸染色法和FQ-PCR檢測敏感度比較

注a,b,c：抗酸染色法在不同性別、年齡和不同病變部位的敏感度比較；d,e,f：FQ-PCR技術(shù)在不同性別、年齡和不同病變部位的敏感度比較；g：抗酸染色法與FQ-PCR技術(shù)在脊柱結(jié)核中敏感度比較；h：抗酸染色法與FQ-PCR技術(shù)在外周骨關(guān)節(jié)結(jié)核中敏感度比較；i：抗酸染色法與FQ-PCR技術(shù)在所有骨關(guān)節(jié)結(jié)核中敏感度的比較

4. PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測非結(jié)核分枝桿菌：對(duì)7例結(jié)核分枝桿菌DNA陰性而抗酸染色查到抗酸桿菌的患者進(jìn)行非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定，檢測出戈登分枝桿菌感染1例。

討 論

傳統(tǒng)病理學(xué)診斷是通過大體和鏡下觀察病灶組織的病理形態(tài)學(xué)改變來獲得診斷結(jié)果。結(jié)核病具有特殊的病理學(xué)形態(tài)特點(diǎn)，如肉芽腫結(jié)構(gòu)，包括類上皮細(xì)胞、朗格漢斯巨細(xì)胞(Langhans giant cell)，以及干酪樣壞死等，可與大多數(shù)其他感染性疾病及慢性炎癥進(jìn)行鑒別診斷[7]。此外，在標(biāo)本中找到抗酸桿菌也是結(jié)核病病理學(xué)診斷的重要依據(jù)。骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷也是如此。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測技術(shù)也逐漸應(yīng)用于病理學(xué)診斷中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是通過特異擴(kuò)增目標(biāo)基因片段而獲得結(jié)果，具有敏感度高、可鑒別診斷結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病(non tuberculous mycobacteria，NTM)等優(yōu)勢，臨床多用于檢測痰液、血液、尿液、腦脊液和胸腔積液等液態(tài)標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌DNA[8]。近年來，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于組織標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌DNA的檢測。羅春英等[9]對(duì)174例肺、淋巴結(jié)、胸腹膜、肝、腎等部位具有肉芽腫性病變的石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌核酸熒光PCR檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌核酸熒光PCR法陽性率明顯高于抗酸染色法(30.5%，14.0%，P<0.05)。王旭洲等[10]比較了肺、淋巴結(jié)、皮膚等200例肉芽腫病變的FQ-PCR技術(shù)與傳統(tǒng)抗酸染色及金胺O染色方法在組織標(biāo)本中的結(jié)核病陽性檢出率，發(fā)現(xiàn)PCR方法的陽性率明顯高于抗酸染色和金胺O染色的陽性率(51.5%、31.0%、40.5%，P<0.05)。而PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟組織標(biāo)本中的應(yīng)用情況，國內(nèi)外罕有報(bào)道。

本研究納入了我院骨科連續(xù)送檢、臨床診斷骨及關(guān)節(jié)結(jié)核、病理組織形態(tài)學(xué)具備肉芽腫性炎和壞死的骨關(guān)節(jié)病變93例，對(duì)其臨床特征觀察發(fā)現(xiàn)：93例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者80.6%在15～歲組，發(fā)病年齡仍以中青年人群為主[11-12]；男性感染者多于女性；脊柱為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的最多發(fā)部位，占所有骨關(guān)節(jié)結(jié)核的1/2以上(53.8%)，其中又以腰椎最為多見，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測較抗酸染色法有明顯優(yōu)勢。FQ-PCR技術(shù)的敏感度明顯高于抗酸染色法(82.8%、68.8%；χ2=5.659，P=0.021)，F(xiàn)Q-PCR法與抗酸染色法相比提高了陽性檢出率，在脊柱結(jié)核中提高20個(gè)百分點(diǎn)，在外周骨關(guān)節(jié)結(jié)核中提高了7個(gè)百分點(diǎn)。在所有93例患者中，兩種方法均為陽性者57例，占61.3%；其中有3例抗酸染色僅查到1株抗酸桿菌，表明兩種方法有較高的一致性；且當(dāng)結(jié)核分枝桿菌菌量少，傳統(tǒng)顯微鏡下查找較困難時(shí)，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)由于具有較高的敏感度，仍可檢測出結(jié)核分枝桿菌。此外，本研究中有20例FQ-PCR陽性患者，其抗酸染色為陰性，對(duì)照患者手術(shù)同時(shí)送檢至我院結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室的病灶膿液標(biāo)本利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(Xpert Mtb/RIF)檢測結(jié)果：12例為陽性，證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌感染；2例未送檢；8例陰性。進(jìn)一步核查8例Xpert檢測陰性患者的臨床治療情況，均對(duì)抗結(jié)核藥物治療反應(yīng)良好。表明FQ-PCR檢測技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中具有較高的敏感度。

NTM是分枝桿菌屬內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌。NTM除侵犯人體肺臟、淋巴結(jié)、皮膚和軟組織外，對(duì)骨骼、關(guān)節(jié)等組織器官也可致病[14]。NTM與結(jié)核分枝桿菌的菌體成分和抗原有其共同性，依靠病理組織形態(tài)和抗酸染色與結(jié)核病很難鑒別。本研究中有7例抗酸染色陽性患者，F(xiàn)Q-PCR檢測結(jié)果為陰性。筆者以PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)7例標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，檢測出1例戈登分枝桿菌感染。對(duì)照患者手術(shù)同時(shí)膿液標(biāo)本的Xpert檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)除戈登分枝桿菌感染患者的Xpert結(jié)果為陰性外，其余6例Xpert結(jié)果為陽性，證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌感染。此例NTM的發(fā)現(xiàn)，不僅為臨床治療提供了重要依據(jù)，也是對(duì)傳統(tǒng)結(jié)核病病理診斷新的挑戰(zhàn)。

病理組織形態(tài)仍是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在組織形態(tài)學(xué)符合結(jié)核病診斷的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗酸染色，為結(jié)核病的診斷提供病原學(xué)依據(jù)。而進(jìn)一步以FQ-PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌特異基因序列是非常有必要的：一方面彌補(bǔ)了抗酸染色由于人為主觀因素造成的假陰性判斷，提高了結(jié)核分枝桿菌的檢出率；另一方面為是否進(jìn)行非結(jié)核分枝桿菌檢測提供了重要提示，有助于區(qū)別非結(jié)核分枝桿菌感染造成的假陽性診斷。

綜上所述， FQ-PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋標(biāo)本的病理學(xué)診斷和鑒別診斷中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

志謝 感謝北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所流行病學(xué)研究室康萬里同志在本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)工作中給予的指導(dǎo)和幫助！

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(本文編輯：范永德)

Application value of fluorescence quantitative PCR technology in detection of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis

MUJing,ZHAODan,LIUZi-chen,CHENan-ying,ZHANGHai-qing.

DepartmentofPathology,BeijingChestHospital，CapitalMedicalUniversity；BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGHai-qing,Email:zhqing56@sina.com

Objective To explore the value of fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) technique in the diagnosis and differential diagnosis of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis (BJTB). Methods Ninety three BJTB specimens and 12 specimens of bone neoplasm were collected during October 2014 to April 2015 in Beijing Chest Hospital, Capital Medical University. Comparison of FQ-PCR technique and conventional acid-fast staining technique in the diagnosis of tuberculosis in sensitivity and specificity by chi square test. To observe the correlation between the different sits and two detection positive rate, and the non tuberculosis mycobacterium was check out by PCR reverse dot blot hybridization in 7 specimens which had negative mycobacterium DNA and acid-fast staining positive. Results BJTB tissues in FQ-PCR detection ofMycobacteriumtuberculosiswere positive in 77 patients, positive rate of 82.8%; 64 cases were acid fast staining positive, positive rate of 68.8%. The sensitivity of FQ-PCR method was significantly higher than that of acid-fast staining (χ2=5.659，P=0.021). In different on set location FQ-PCR sensitivity were higher than that of acid fast staining: in the spine, FQ-PCR technique and acid fast staining positive rate was 84.0% (42/50) and 64.0% (32/50) (χ2=0.009，P=0.609) respectively; in the peripheral BJTB, FQ-PCR and acid fast staining positive rate were 81.4% (35/43) and 74.4% (32/43) (χ2=12.609，P=0.002) respectively.A strain of mycobacterium Gordon was checked out by PCR-reverse dot blot hybridization. Conclusion FQ-PCR technique improved the positive detection rate ofMycobacteriumtuberculosissignificantly compared to acid-fast staining and provide important tips for testing non tuberculosis mycobacterium. The FQ-PCR technology has good application value in the detection of paraffin-embedded specimens from BJTB.

Mycobacteriatuberculosis; Tuberculosis, Bone and Joint; Polymerase chain reaction; Acid-fast staining

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.009

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)基金(2014-4-2161)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所病理科

張海青，Email：zhqing56@sina.com

2016-01-12)