李敏　胡金梅　張錦　李秀輕　李瑋桓　苑巍

063000　河北省唐山市，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部(李敏、胡金梅、張錦、李瑋桓、苑巍)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(李秀輕)

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·藥物研究·

液質(zhì)聯(lián)用分析間尼索地平消旋體大鼠組織分布特征

李敏胡金梅張錦李秀輕李瑋桓苑巍

063000河北省唐山市，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部(李敏、胡金梅、張錦、李瑋桓、苑巍)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(李秀輕)

【摘要】目的利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究大鼠體內(nèi)間尼索地平消旋體的組織分布特征。方法20℃下，利用C18柱，以乙腈-水(70∶30, v/v)為流動(dòng)相，流速為0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。掃描方式采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè),離子化模式采用ESI選擇性負(fù)離子檢測(cè)。組織勻漿液采用正己烷-乙醚(1∶1)萃取，進(jìn)樣LC-MS-MS分析。結(jié)果大鼠灌胃給予間尼索地平消旋體20 mg/kg后，在大鼠小腸、肺和肝中，30和150 min的分布量均較90 min高，在腦組織中也有一定的分布。結(jié)論本法靈敏度高，操作方便，適合于大鼠體內(nèi)間尼索地平消旋體的組織分布研究，為其臨床實(shí)驗(yàn)研究與新藥申報(bào)提供了理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】間尼索地平；消旋體；液質(zhì)聯(lián)用；藥動(dòng)學(xué)

目前，高血壓是最常見的慢性病，也是引起心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，高血壓可能會(huì)導(dǎo)致腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎臟病等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此，研制與開發(fā)防治高血壓的藥物具有重要的社會(huì)意義。間尼索地平(m-Nisoldipine)消旋體作為新型的1，4-二氫吡啶類鈣拮抗劑[1,2]，在降壓方面效果顯著[3-5]。本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，采用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS-MS)技術(shù)[6-8]對(duì)間尼索地平消旋體在大鼠體內(nèi)的組織分布特征進(jìn)行全面研究[9-12]。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100LC/MSD色譜系統(tǒng)API 4000型液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，電噴霧離子化源(ESI源)(美國(guó)ABI公司)；液相色譜輸液泵：Shimadzu 20A 系統(tǒng)：二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱(日本Shimadzu公司)；MDS Sciex Analyst software (美國(guó)ABI公司)；LG16-W型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2試藥間-尼索地平對(duì)照品(河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)Tedia公司)。 SD大鼠，20只，體重(250±10)g左右，雄性(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；合格證編號(hào)為DK0705-0076號(hào))。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，飲水不限。

1.3配制間尼索地平消旋體混懸液和對(duì)照品溶液

1.3.1間尼索地平消旋體混懸液：精密稱取間尼索地平消旋體約125 mg，加入羧甲基纖維素鈉(0.5%)50 ml，振搖5 min使混勻，即得2.5 mg/ml的間尼索地平消旋體混懸藥液。

1.3.2對(duì)照品溶液：精密稱取適量間尼索地平消旋體對(duì)照品，置于量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度配制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(20 μg/ml)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4制備和預(yù)處理組織樣本

1.4.1樣品制備：灌胃給予大鼠混懸藥液后，于10 min、30 min、90 min和150 min[13,14]處死，并迅速取出大鼠各器官，用0.9%氯化鈉溶液沖洗組織，濾紙吸干表面水分，加3倍量0.9%氯化鈉溶液制成1∶3的組織勻漿，-20℃冰箱保存。

1.4.2預(yù)處理：在避光條件下，將冷凍保存的組織勻漿置于37℃水浴上融化，取1.0 ml勻漿液置試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)乙腈溶液(20 μg/ml)10 μl，NaOH(5 mol/L)水溶液50 μl，旋渦10 s，用3 ml正己烷-乙醚(1∶1，v/v)提取，旋渦1 min，4 000 r/min離心10 min，取2 ml上清液，氮?dú)獯蹈桑?0 μl甲醇溶解，旋渦2 min，10 000 r/min離心10 min，取20 μl作LC-MS-MS分析。同法取空白組織，-20℃冰箱保存。

1.5選擇LC-MS-MS條件

1.5.1色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm；4.6 μm)；溫度：20℃；流動(dòng)相：乙腈-水(70∶30, v/v)；進(jìn)樣量：50 μl；流速：0.8 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm。

1.5.2MSD：電噴霧離子化(ESI)源；噴霧電壓IS-4 000 V；霧化溫度500℃；霧化氣NEB(GAS 1)為40 L/min；輔助氣AUX(GAS 2)為40 L/min；簾氣CUR為20 L/min；碰撞氣CAD為8 L/min；碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓為27 V；駐留時(shí)間(dwell time)為100 ms；檢測(cè)方式為負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 387.0→m/z122.0(間尼索地平消旋體)。

2方法與結(jié)果

2.1專屬性間尼索地平消旋體的ESI一級(jí)全掃描質(zhì)譜主要生成準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z 387.0。選擇性對(duì)[M-H]-進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，間尼索地平的主要碎片離子為m/z 122.0，將其作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。測(cè)得大鼠空白各組織、空白各組織加樣及各組織中間尼索地平消旋體的保留時(shí)間為6.11 min，且內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。見圖1。

圖1　間尼索地平準(zhǔn)分子離子峰及其產(chǎn)物離子峰質(zhì)譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限在避光條件下，精密吸取不同體積的間尼索地平消旋體儲(chǔ)備液，揮盡溶媒，精密加入大鼠各空白組織勻漿1.0 ml，按“1.4”項(xiàng)下同法操作，制備成40 μl甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20 μl，按上述色譜條件測(cè)定，以組織中間尼索地平消旋體峰面積(A)對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，組織中間尼索地平消旋體濃度在7～1 500 ng/ml范圍內(nèi)，質(zhì)譜響應(yīng)線性關(guān)系良好。各組織中間尼索地平消旋體的定量下限均為0.5 ng/ml。見表1。

2.3準(zhǔn)確度與精密度取各空白組織勻漿液，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，分別制作成20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3種 濃度間尼索地平對(duì)照品組織樣品各5份，依法測(cè)定，結(jié)果上述3種濃度下，大鼠各組織中間尼索地平消旋體準(zhǔn)確度、日內(nèi)及日間精密度均≤15%。

表1　間尼索地平消旋體在大鼠各組織樣本中的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性

2.4回收率取各空白組織勻漿液，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，分別制成20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3種濃度間尼索地平對(duì)照品組織樣品各5份，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算大鼠各組織中3種不同濃度間尼索地平消旋體的回收率均大于80%，其相對(duì)偏差均小于15%。

2.5樣品穩(wěn)定性考察取各空白組織勻漿液1.0 ml，按“1.4”項(xiàng)下方法制備20.0、500.0、1 200.0 ng/ml 3種 濃度間尼索地平對(duì)照品組織樣品各5份，考察其室溫放置4 h，樣品預(yù)處理后室溫放置4 h、24 h及經(jīng)3次冷凍-解凍循環(huán)后間尼索地平消旋體的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，間尼索地平消旋體組織樣品在上述條件下均穩(wěn)定，相對(duì)誤差均在±15%，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定。

2.6大鼠組織分布實(shí)驗(yàn)[13,14]20只SD大鼠，隨機(jī)分為4組，按每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠實(shí)驗(yàn)。取“1.3”項(xiàng)下混懸藥液以20 mg/kg按大鼠體重分別灌胃給藥。隨后在所設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)，斷頸處死大鼠，迅速取出肺、肝、腎、心、腦和小腸，按“1.4”項(xiàng)下方法處理，備用。按“1.5”項(xiàng)下測(cè)定大鼠各組織器官在各時(shí)間點(diǎn)濃度。結(jié)果顯示，間尼索地平主要分布在大鼠小腸、肺和心中，且30和150 min時(shí)各組織中濃度均較90 min高。見表2。

表2大鼠口服20 mg/kg間尼索地平消旋體各時(shí)間點(diǎn)

各組織樣本中分布濃度

組織10min30min90min150min小腸1.21±0.341.43±0.520.53±0.251.38±0.67肺0.53±0.210.51±0.340.08±0.070.26±0.11心0.32±0.120.76±0.280.33±0.340.24±0.13腎0.05±0.040.08±0.060.05±0.020.04±0.03肝0.15±0.070.34±0.240.08±0.060.10±0.12腦0.06±0.070.09±0.010.06±0.050.05±0.04

3討論

高血壓已成為臨床常見病和引發(fā)心腦血管并發(fā)癥最嚴(yán)重的疾病之一，而有效抗高血壓藥物治療可以預(yù)防由高血壓引起的腦血管意外、心功能衰竭和腎功能不全，并明顯降低其病死率。由于部分高血壓患者并無(wú)明顯的臨床癥狀，高血壓又被稱為人類健康的“無(wú)形殺手”，所以提高對(duì)高血壓病的認(rèn)識(shí)，對(duì)早期預(yù)防、及時(shí)治療有極其重要的意義。因此研制高效的治療高血壓的藥物是亟待解決的問題。

3.1鈣拮抗劑是目前治療高血壓和心絞痛的主要藥物。其中二氫吡啶類鈣拮抗劑(DHP-CaA)特異性高、作用強(qiáng)，發(fā)展迅速，臨床效果良好，與其他類型的降壓藥可聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)療效，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

本實(shí)驗(yàn)中間尼索地平消旋體作為二氫吡啶類鈣拮抗劑，藥理作用與尼索地平相似[3-5]，而光穩(wěn)定性明顯優(yōu)于德國(guó)公司研制的尼索地平，具有自身優(yōu)勢(shì)，有巨大的開發(fā)潛力。

3.2本文首先采用甲醇、乙腈沉淀蛋白的方法對(duì)組織樣品進(jìn)行處理，萃取回收率低于50%，且在間尼索地平消旋體出峰的位置有內(nèi)源性物質(zhì)干擾，因此采用液-液萃取法對(duì)組織樣品進(jìn)行純化，分別考察了正己烷、環(huán)己烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷-乙醚(1∶1)、乙醚、正己烷-乙酸乙酯(1∶1)的提取效果。除乙醚，正己烷和正己烷-乙醚(1∶1)萃取內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾外，其余均有干擾峰出現(xiàn)?？紤]乙醚的沸點(diǎn)低，不宜精密量取，正己烷-乙醚(1∶1)經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，易于量取且回收率高于70%，因此采用正己烷-乙醚(1∶1)作組織樣本預(yù)處理的萃取溶劑[15,16]。

3.3由組織分布結(jié)果可見，間尼索地平消旋體在小腸分布居多，可能與大鼠口服用藥有關(guān)，同時(shí)也說明該藥可能對(duì)小腸吸附性較強(qiáng)，在腸道菌產(chǎn)生的多種消化酶和酵素作用下，可能會(huì)轉(zhuǎn)化為代謝物。在大鼠腦組織中測(cè)到部分原型藥物，說明該藥能夠透過血腦屏障，進(jìn)而進(jìn)入腦組織中。同時(shí)，肺和腦組織中均存在有一定量的間尼索地平消旋體，表明了該藥脂溶性較大。此外，小腸、心和肺組織中藥物分布濃度較高，這些組織既是主要效應(yīng)器官，也是藥物產(chǎn)生毒性的重要部位。因此，對(duì)該藥進(jìn)行藥效學(xué)和毒理學(xué)研究勢(shì)在必行。

3.4鑒于間尼索地平消旋體在小腸、肺和肝組織中，30和150 min的濃度均較90 min高，因此該藥在大鼠體內(nèi)很可能存在肝腸循環(huán)。肝腸循環(huán)又稱為腸肝循環(huán)，指經(jīng)膽汁或部分經(jīng)膽汁排入腸道的藥物，在腸道中又重新被吸收，經(jīng)門靜脈又返回肝臟的現(xiàn)象。此現(xiàn)象主要發(fā)生在經(jīng)膽汁排泄的藥物中，有些由膽汁排入腸道的原型藥物如毒毛旋花子苷G，極性高，很少能再?gòu)哪c道吸收，而大部分從糞便排出。有些藥物如氯霉素、酚酞等在肝內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合后，水溶性增高，分泌入膽汁，排入腸道，在腸道細(xì)菌酶作用下水解釋放出原型藥物，又被腸道吸收進(jìn)入肝臟。因此對(duì)間尼索地平在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程有必要進(jìn)行深入的研究。

3.5本文采用液-液萃取對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，首次建立了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大鼠組織中間尼索地平消旋體含量的分析方法，研究了該藥在大鼠各組織中的分布特征。所建立方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，為臨床研究與設(shè)計(jì)給藥方案提供參考。

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(收稿日期：2015-12-17)

【中圖分類號(hào)】R 912

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)09-1423-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.048

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20130069)