楊蓉　常亮　王亞玲　苗成龍　賈妍　李擁軍

050000　石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科

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·論著·

AT1-R-JAK/STAT信號通路對肥大心肌細胞表達內(nèi)脂素的調(diào)節(jié)

楊蓉常亮王亞玲苗成龍賈妍李擁軍

050000石家莊市,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科

【摘要】目的觀察心肌細胞肥大過程中應(yīng)用不同的信號通道阻斷劑阻斷AngⅡ作用后內(nèi)脂素的表達情況，研究內(nèi)脂素水平變化的意義。方法采用SD乳鼠(出生2～3 d)，利用差速貼壁法提取原代心肌細胞并進行培養(yǎng)，48 h 后改為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后分組。分別應(yīng)用不同的信號通道阻斷劑阻斷AngⅡ的干預(yù)作用。應(yīng)用RT-PCR、Western-Blot技術(shù)檢測心肌細胞中內(nèi)脂素表達情況，應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測心肌細胞腦氨鈉素(BNP)表達情況。結(jié)果心肌細胞活力(光密度值)和BNP表達水平在AngⅡ濃度為10(-8)、10(-7)、10(-6) mol/L時逐漸升高，AngⅡ濃度為10(-6) mol/L時達峰值，而AngⅡ濃度升高為10(-5) mol/L時心肌細胞活力下降，BNP表達水平下降。內(nèi)脂素和內(nèi)脂素mRNA水平，在AngⅡ濃度為10(-8)、10(-7)、10(-6) mol/L時呈逐漸升高趨勢，AngⅡ濃度為10(-5) mol/L時達峰值。在AngⅡ濃度為10(-6) mo1/L時，心肌細胞活力、內(nèi)脂素mRNA表達和內(nèi)脂素蛋白表達與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。心肌細胞MTT產(chǎn)物(OD值)、內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達、BNP蛋白表達水平，隨時間延長而增加。PD123319預(yù)干預(yù)組和AngⅡ干預(yù)組內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組和替米沙坦預(yù)干預(yù)組(P<0.05)。AngⅡ組內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達水平與對照組、AG490+AngⅡ組、SP600125+AngⅡ組和U0126+AngⅡ組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AG490+AngⅡ組、SP600125+AngⅡ組和U0126+AngⅡ組明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大中內(nèi)脂素表達的增加，由AT1-R-JAK/STAT信號通路所介導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】心肌細胞；內(nèi)酯素；血管緊張素；肥大

心肌肥厚常常為適應(yīng)機體做功的不斷增加而發(fā)生的適應(yīng)性改變，這種快速肥厚性反應(yīng)具有一定的代償效果。在代償反應(yīng)過程中，交感神經(jīng)興奮、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活發(fā)揮了重要作用。其中，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是導(dǎo)致心肌細胞肥大的主要影響因子之一[1]。短期內(nèi)觀察，肥大的心肌可以維持甚至增加心輸出量，但隨著心肌肥大的發(fā)展，心肌氧耗量也會進一步增加，從長遠來看，“代償性”肥大終將發(fā)展為“失代償性”心臟擴大，出現(xiàn)心肌纖維化和細胞凋亡，冠狀動脈血流儲備也將隨之而降低，導(dǎo)致心功能下降，心力衰竭的發(fā)生。研究表明，AngⅡ可以激活多條細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致非依賴壓力超負荷性的心肌細胞肥大和機械性功能紊亂[2,3]，即使無高壓力負荷的情況下也具有直接的促進心肌細胞肥大的效應(yīng)。心肌細胞肥厚的過程中常伴隨著肥厚基因的過表達及相關(guān)蛋白質(zhì)合成的增加，其中腦鈉素(brain natriuretic peptide，BNP)是反應(yīng)心肌肥厚及心力衰竭的代表性生化標(biāo)志物[4,5]。內(nèi)脂素在人體多種組織廣泛表達,在風(fēng)濕性疾病、肥胖、糖尿病、炎性反應(yīng)等病理生理情況下，血漿內(nèi)脂素水平明顯升高。筆者所見內(nèi)脂素在心血管系統(tǒng)的作用也有很多報道，但多局限于體內(nèi)實驗，目前有關(guān)內(nèi)脂素在心臟細胞水平的表達，及其在心肌細胞肥大中的作用及其機制的研究筆者未見報道。本研究觀察在AngⅡ刺激下肥大心肌細胞中內(nèi)脂素的表達情況，以及可能的病理生理機制，以探討內(nèi)脂素在心肌肥厚進程的作用，為臨床心力衰竭患者開拓新的診治思路。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑(1)儀器：PCR儀(ABI公司)，恒溫振蕩器(THZ-C,中國江蘇太倉試驗設(shè)備廠)，GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。(2)試劑胎牛血清(中國北京索來寶公司)，D-葡萄糖(分析純,重慶北碚化學(xué)試劑廠)，BNP兔抗鼠一抗(美國Abcam公司)，Trizol試劑(SBS公司)，Visfatin一抗:山羊抗大鼠sc-46400(美國Santa公司)。

1.2細胞提取及培養(yǎng)選取河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的Sprague-Dawley(SD)大鼠，日齡2～3 d，雌雄不分，清潔級。剪取乳鼠心臟前1/3的心室部分，利用差速貼壁法分離出心肌細胞。使用5-BrdU驅(qū)除成纖維細胞的干擾。

1.3分組及處理心肌細胞首先進行48 h常規(guī)原代培養(yǎng)，24 h后改為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。之后將6孔板上的細胞每6孔分為1組，換培養(yǎng)基的同時進行分組。首先分為：對照組、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L AngⅡ干預(yù)心肌細胞48 h。然后，根據(jù)上述分組實驗結(jié)果選取對內(nèi)脂素和BNP影響最大的AngⅡ濃度分別干預(yù)心肌細胞：0、6、12、24、48 h。最后，根據(jù)上述前期實驗結(jié)果選取對內(nèi)脂素和BNP影響最大的AngⅡ濃度(10-6mol/L)干預(yù)心肌細胞24 h，分別應(yīng)用不同的信號通道阻斷劑阻斷AngⅡ的作用：(1)首先應(yīng)用替米沙坦(10 μmol/L)和PD123319 (10 μmol/L)分別阻斷AngⅡ 1型受體(AngⅡ type-1 receptor,AT1-R)和AngⅡ 2型受體(AngⅡ type-2 receptor,AT2-R)。心肌細胞首先應(yīng)用替米沙坦和PD123319預(yù)干預(yù)30 min，隨后應(yīng)用AngⅡ(10-6 mol/L)干預(yù)24 h。(2)應(yīng)用SP600125、U0126和AG490，分別阻斷AT1-R下游通道：JNK(c-Jun NH 2-terminal kinase)、ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase)和JAK(Janus kinase)。細胞首先應(yīng)用SP600125(10 μmol/L)、U0126(10 μmol/L)和AG490預(yù)干預(yù)30 min，隨后應(yīng)用AngⅡ(10-6mol/L)干預(yù)24 h。

1.4RT-PCR方法檢測心肌細胞內(nèi)脂素mRNA的表達美國medline國立圖書館基因庫檢索基因，引物由賽百盛生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。內(nèi)脂素(上游引物5-ACTTTGAATGCCGTGAA-3，下游引物5-AATCCAGTTGGTGAGCC-3。GAPDH上游引物5-GAGGCTCTCTTCCAGCCTTC-3，下游引物5-AGGGTGTAAAAGCAGCTCA-3)。采用TRIZOL法遵照SBS公司相關(guān)說明書進行心肌細胞總RNA的提取,取8 μl擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳；凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，結(jié)果以內(nèi)脂素與GAPDH光密度的比值表示。

1.5Western blot方法分析檢測內(nèi)脂素及BNP蛋白的表達胰酶消化收集心肌細胞于離心管中，離心后加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑RIPA，離心后用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，分裝上清用于加樣。配制9%的分離膠及4%的濃縮膠，將總蛋白加至上樣孔中，進行SDS-PAGE恒壓電泳，染色轉(zhuǎn)膜后，雜交、顯色，用封閉液將一抗稀釋。包被一抗、二抗，膜用TBST液洗3次，每次5 min。用ECL發(fā)光試劑盒進行顯色。洗滌好的膜擺放到保鮮膜上，將底物工作液加到膜上后立即用保鮮膜包好，迅速放入暗盒中進行曝光。暗室中小心的將X線片壓到膜上，適當(dāng)曝光，顯影，定影。凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描。

1.6MTT法檢測心肌細胞活力心肌細胞以1×105/ml的密度種植于96孔細胞培養(yǎng)板中，按照實驗方法處理心肌細胞后，加入5 mg/ml MTT溶液20 μl與培養(yǎng)基中，在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后每孔加入150 μl的DMSO，并震蕩10 min，將96孔細胞培養(yǎng)板置入全自動酶標(biāo)儀，在490 nm波長處測定其光吸收值。

2結(jié)果

2.1AngⅡ干預(yù)48 h后心肌細胞活力及內(nèi)脂素和BNP的變化

2.1.1心肌細胞活力(光密度值)和BNP表達水平:在AngⅡ濃度為10-8、10-7、10-6mol/L時呈逐漸升高趨勢，AngⅡ濃度為10-6mol/L時達峰值，而AngⅡ濃度升高為10-5mol/L時心肌細胞活力下降，BNP表達水平下降。

2.1.2內(nèi)脂素和內(nèi)脂素mRNA水平:在AngⅡ濃度為10-8、10-7、10-6mol/L時呈逐漸升高趨勢，AngⅡ濃度為10-5mol/L時達峰值，在AngⅡ濃度升高為10-4mol/L 時內(nèi)脂素和內(nèi)脂素mRNA水平均升高，但與AngⅡ濃度為10-5mol/L時比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1～3，圖1。

表1不同濃度AngⅡ濃度干預(yù)48 h的情況

指標(biāo)對照組AngⅡ10-8mol/LAngⅡ10-7mol/LAngⅡ10-6mol/LAngⅡ10-5mol/L心肌細胞活力0.793±0.0490.966±0.50*1.099±0.047*1.181±0.042*1.040±0.053*BNP蛋白質(zhì)表達0.153±0.0150.248±0.007*0.356±0.015*0.467±0.003*0.410±0.017*內(nèi)脂素mRNA表達0.497±0.0060.506±0.0050.627±0.012*0.690±0.011*0.700±0.010*內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達0.250±0.0100.263±0.0060.744±0.011*0.919±0.022*0.942±0.016*

注：與對照組比較，*P<0.01

表2AngⅡ濃度10-6mol/L干預(yù)心肌細胞不同時間情況

指標(biāo)對照組6h12h24h48h心肌細胞活力0.753±0.0321.034±0.039*1.261±0.052*1.214±0.031*1.173±0.053*BNP蛋白質(zhì)表達0.157±0.0060.164±0.0140.192±0.009*0.405±0.005*0.387±0.015*

注：與對照組比較，*P<0.01

表3AngⅡ濃度10-6mol/L干預(yù)心肌細胞不同時間情況

指標(biāo)6h對照組AngⅡ12h對照組AngⅡ24h對照組AngⅡ48h對照組AngⅡ內(nèi)脂素mRNA表達0.506±0.0180.552±0.017*0.484±0.0170.564±0.017*0.512±0.0180.756±0.041*0.507±0.0180.685±0.012*內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達0.243±0.0060.572±0.020*0.240±0.0050.577±0.023*0.247±0.0060.984±0.027*0.250±0.0100.927±0.015*

注：與對照組比較，*P<0.01

圖1不同濃度AngⅡ 干預(yù)48 h，(A) 心肌細胞活力變化；(B) BNP蛋白質(zhì)的表達；(C)內(nèi)脂素mRNA表達；(D) 內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達。1, 對照組; 2, AngⅡ 10-8mol/L; 3, AngⅡ 10-7mol/L; 4, AngⅡ 10-6mol/L; 5, AngⅡ 10-5mol/L

2.2AngⅡ濃度為10-6mol/L時心肌細胞不同時間活力及內(nèi)脂素和BNP的變化心肌細胞在AngⅡ濃度為10-6mol/L時，心肌細胞活力、內(nèi)脂素mRNA表達和內(nèi)脂素蛋白表達與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。心肌細胞MTT產(chǎn)物(OD值)、內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達、BNP蛋白表達水平，隨時間延長而增加，其中心肌細胞MTT產(chǎn)物(OD值)在12 h達峰值，內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達、BNP蛋白表達水平在24 h達峰值，前者在48 h后顯著下降，后者下降輕微。見表4，圖2。

表4AngⅡ10-6mol/L刺激心肌細胞24 h情況

指標(biāo)對照組AngⅡ替米沙坦+AngⅡPD123319+AngⅡ內(nèi)脂素mPNA表達0.493±0.0060.763±0.015*0.500±0.0100.790±0.017*內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達0.265±0.0130.977±0.021*0.270±0.0171.018±0.015*

注：對照組比較，*P<0.01

2.3受體拮抗劑對內(nèi)脂素mRNA和內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達的影響PD123319預(yù)干預(yù)組和AngⅡ干預(yù)組內(nèi)脂

圖2AngⅡ濃度10-6mol/L干預(yù)心肌細胞不同時間，觀察(A) 心肌細胞活力變化；(B)內(nèi)脂素mRNA表達； (a, 對照; b, AngⅡ)(C)內(nèi)脂素蛋白質(zhì)的表達 (a, 對照; b, AngⅡ)；(D)BNP蛋白質(zhì)的表達變化。1, 對照組; 2, 6 h; 3, 12 h; 4, 24 h; 5, 48 h

素mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組和替米沙坦預(yù)干預(yù)組(P<0.05)，替米沙坦預(yù)干預(yù)組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PD123319預(yù)干預(yù)組內(nèi)脂素mRNA和內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達水平高于AngⅡ干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AngⅡ組內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達水平與對照組、AG490+AngⅡ組、SP600125+AngⅡ組和U0126+AngⅡ組

比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AG490+AngⅡ組、SP600125+AngⅡ組和U0126+AngⅡ組明顯高于正常對照組(P<0.05)，AG490+AngⅡ組內(nèi)脂素mRNA和蛋白表達水平與SP600125+AngⅡ組和U0126+AngⅡ組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、5，圖3。

表5AngⅡ10-6mol/L刺激心肌細胞24 h情況

指標(biāo)AG490AG490+AngⅡU0126U0126+AngⅡSP600125SP600125+AngⅡ?qū)φ战MAngⅡ內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達0.247±0.0180.312±0.020*0.249±0.0170.798±0.023*0.260±0.0180.811±0.026*0.246±0.0120.951±0.041*內(nèi)脂素mRNA的表達0.499±0.0200.496±0.027 0.510±0.0230.500±0.027 0.739±0.035*0.551±0.011*0.637±0.022*0.650±0.016*

注：與對照組比較，*P<0.01

圖3AngⅡ 10-6mol/L刺激心肌細胞24 h，應(yīng)用AngⅡ受體拮抗劑對(A)內(nèi)脂素mRNA表達和(B)內(nèi)脂素蛋白質(zhì)的表達的影響；(1, 對照組; 2, AngII; 3, 替米沙坦+AngⅡ; 4, PD123319+AngⅡ)。AngⅡ 10-6mol/L刺激心肌細胞24 h，應(yīng)用不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑對(C)內(nèi)脂素蛋白質(zhì)表達和(D)內(nèi)脂素mRNA的表達的影響；(AG490 (20 μmol/L), U0126 (20 μmol/L) or SP600125 (20 μmol/L)

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，BNP雖然在心臟等多種組織中均有表達，但通常情況下，表達水平比較低。但當(dāng)心肌張力明顯增高時，BNP在心室中表達水平迅速增加。常通過激活PKG、pGC、KATP通道發(fā)揮作用[6]。本實驗采用AngⅡ?qū)π募〖毎M行刺激，使心肌細胞肥大，對BNP蛋白表達進行檢測，從而評估心肌細胞的狀態(tài)。

內(nèi)脂素作為生長刺激因子，主要分布于肌肉、肝臟、骨髓間質(zhì)細胞等，心臟也可產(chǎn)生，并對心臟產(chǎn)生作用，其可以發(fā)揮類胰島素作用、促進細胞增殖和抗凋亡等作用[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用可導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)內(nèi)脂素和BNP表達水平的增長，且與AngⅡ作用的劑量和時間相關(guān)，其中內(nèi)脂素水平升高可能與AngⅡ作用心肌細胞，后者耗氧量增加有關(guān)。Hsu等[9,10]研究表明AngⅡ能夠?qū)е滦募〖毎蛲觯鴥?nèi)脂素能對其產(chǎn)生抑制作用。上述結(jié)論可以推斷，心肌細胞凋亡在一定程度上能夠引起內(nèi)脂素水平升高。

AngⅡ受體中AngⅡ I型受體和AngⅡⅡ型受體通過不同的作用機制，均可導(dǎo)致心肌細胞肥大[11]。替米沙坦和PD123319分別是AT1-R和 AT2-R特異性阻斷劑。本研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦可以抑制AngⅡ引起的心肌細胞內(nèi)內(nèi)脂素水平的升高，說明AngⅡ引起的心肌細胞肥大是由AT1-R介導(dǎo)內(nèi)脂素表達增加而產(chǎn)生的[12]。本研究中AngⅡ作用可導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)內(nèi)脂素和BNP表達水平的增長，且與AngⅡ作用的劑量和時間相關(guān)，其中內(nèi)脂素水平升高可能與AngⅡ作用心肌細胞，后者耗氧量增加有關(guān)。而AT2-R基因的過度表達可以抑制心肌細胞的耗氧量增加。由此推斷，AT1-R可以增加心肌細胞蛋白質(zhì)合成、減少凋亡[13]。而AT2-R在抑制心肌細胞肥大和促進心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[14,15]。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽，其通過受體AT1使心肌細胞蛋白合成速度增加，心肌纖維細胞的基質(zhì)和分泌水平升高，從而發(fā)生心肌肥厚，甚至發(fā)生心肌纖維化，影響患者的心臟功能。AT1-R阻斷劑能夠抑制內(nèi)脂素水平升高，阻斷心肌肥厚發(fā)生的通路。

研究發(fā)現(xiàn)，在乳鼠心肌細胞中AngⅡ可以通過AT1-R激活JNK[16]。ERK是與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大密切相關(guān)的MAPK家族的關(guān)鍵成員[17]。JAK/STAT是另外一個與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大密切相關(guān)的信號通道，并且與MAPK家族不同。最近研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT信號通路在心臟病理性肥厚中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而且，JAK/STAT信號通路在AngⅡ的自分泌環(huán)中發(fā)揮重要作用，這個環(huán)路可以放大AngⅡ?qū)π募〖毎淖饔肹18]。本研究可能是由于AG490阻斷了JAK/STAT介導(dǎo)的AngⅡ的自分泌環(huán)，阻斷了心肌內(nèi)源性AngⅡ分泌。說明AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大過程中內(nèi)脂素表達的增加主要是由JAK/STAT信號通路介導(dǎo)的。

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The regulation effects of AT1-R-JAK/STAT signal pathway on expressions of visfatin in hypertrophy myocardial cells in vitro

YANGRong,CHANGLiang,WANGYaling,etal.

TheSecondHospotalofHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expressions of visfatin in angiotensin Ⅱ(AngⅡ)-induced cardiomyocyte hypertrophy in vitro after blocked by different signal channel blockers,and to explore the significance of changes of visfatin levels.MethodsThe primary generation cardiomyocytes from Sprague-Dawley (SD) neonate rats (2～3d age) were cultured in vitro with routine medium,however, which were cultured in medium without serum after 48 hours. The cardiomyocytes were divided into different groups after 24 hours,and the intervention effects of AngⅡ were blocked by different signal channel blockers. The expression levels of visfatin in cardiomyocytes were detected by RT-PCR,Western-Blot,respectively,moreover, the expression levels of brain natriuretic peptide (BNP) in cardiomyocytes were detected by Western-Blot.ResultsThe activity of cardiomyocytes (optical density value,OD) and expression levels of BNP were gradually increased when AngⅡ concentration at 10(-8),10(-7),10(-6)mol/L.The activity of cardiomyocytes and expression levels of BNP were decreased when AngⅡ concentration at 10(-5)mol/L.The levels of visfatin and visfatin mRNA were increased when AngⅡ concentration at 10(-8),10(-7),10(-6)mol/L,which reached peak at 10(-5)mol/L. There were significant differences in the activity of cardiomyocytes and expression levels of visfatin mRNA and protein when AngⅡ concentration at 10(-6)mol/L between experimental group and control group (P<0.05).The OD value of cardiomyocytes,expression levels of visfatin mRNA and protein,expression levels of BNP protein were increased,with the time went on.The expression levels of visfatin mRNA and protein in PD123319 intervention group and AngⅡ intervention group were significantly high than those in control group and telmisartan intervention group (P<0.05). There were significant differences in the expression levels of visfatin mRNA and protein between AngⅡ group and control group and between AG490+AngⅡ group,SP600125+ AngⅡgroup and U0126+AngⅡgroup (P<0.05), moreover,which in AG490+AngⅡ group,SP600125+ AngⅡ group and U0126+AngⅡ group were significantly higher than those in control group (P<0.05).ConclusionThe enhancement of visfatin expression levels in AngⅡ-induced cardiomyocyte hypertrophy is mediated by AT1-R-JAK/STAT signal pathway.

【Key words】cardiomyocyte;visfatin;angiotensin;hypertrophy

(收稿日期：2015-11-22)

【中圖分類號】R 329.2

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1292-05

通訊作者：常亮，050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.003

E-mail:mrmist0920@163.com