張國君　劉卓剛

110022　沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液內(nèi)科

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·論著·

microRNA-103b在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)及意義

張國君劉卓剛

110022沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液內(nèi)科

【摘要】目的微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21-25nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子。本研究旨在探討miR-103b在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中的表達(dá)及臨床意義。方法用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測80例初診ALL患者和20例正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR-103b的相對表達(dá)量，并與患者臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果miR-103b在ALL患者中的相對表達(dá)量高于正常對照組(P<0.05)，但其在急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)及急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-103b的表達(dá)與是否存在bcr-abl融合基因及其mRNA的表達(dá)水平無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論miR-103b在ALL患者中表達(dá)上調(diào)，可作為臨床診斷ALL的潛在分子標(biāo)記物，bcr-abl融合基因的表達(dá)對miR-103b在ALL中的表達(dá)無明顯影響。

【關(guān)鍵詞】淋巴細(xì)胞白血病，急性；bcr-abl；microRNA-103b

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病。不同亞型白血病在不同年齡人群中的發(fā)病率和預(yù)后都不相同，盡管細(xì)胞遺傳學(xué)的技術(shù)進(jìn)步使我們對白血病進(jìn)行更準(zhǔn)確地診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層和指導(dǎo)治療，然而，仍然有約1/4的兒童和更高比例的成人存在周期性復(fù)發(fā)[1]。因此，需要我們更深入的了解不同亞型白血病間的分子機(jī)制，辨識預(yù)測治療失效的風(fēng)險(xiǎn)基因和有助于新型療法的靶向基因。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA。據(jù)推測人類基因組可以編碼上千種miRNA。miRNA參與細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞發(fā)育和分化、代謝、細(xì)胞周期和凋亡等及重要炎癥調(diào)節(jié)[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， miRNA在腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織和外周血中異常表達(dá)，提示在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生中具有重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與急性淋巴細(xì)胞性白血病的惡性增殖、 診斷、預(yù)后和治療密切相關(guān)[4]，針對 miRNA的治療有望開辟新型的治療途徑。本研究通過檢測miRNA-103b在ALL患者中的表達(dá)，結(jié)合臨床資料，探討miR-103b在ALL發(fā)生、發(fā)展中的作用及潛在的臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料以2014年1月至 2015年 9月我院初診ALL患者80例(ALL組)為研究對象，所有患者經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫分型、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查明確診斷為ALL。80例ALL患者中男44例，女36例；中位年齡34歲。正常為同期來我院就診的20例骨髓像大致正?；颊叩墓撬铇?biāo)本，其中男11例，女9例；中位年齡29歲。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器人淋巴細(xì)胞分離液購自德國Sigma公司，Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，氯仿、無水乙醇、異丙醇購自上海生工生物工程股份有限公司，Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit和Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR Kit購自日本Takara Clontech公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM購自日本Takara公司，bcr-abl(p190)融合基因熒光定量檢測試劑盒購自上海通派生物科技有限公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國Sigma公司，超微量紫外分光光度計(jì)購自德國IMPLEN公司，LC480熒光定量PCR儀購自瑞士ROCHE公司。

1.3單個(gè)核細(xì)胞的分離與總RNA的制備骨髓肝素抗凝，加入淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心，分離單個(gè)核細(xì)胞。用TRIzol提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA， 超微量紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和度，已制備的總RNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCRbcr-abl(p190)融合基因逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照bcr-abl(p190)融合基因熒光定量檢測試劑盒說明書配制反應(yīng)液，并于LC480熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:2×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液10 μl，50 nmol/LHas miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物/U6 snRNA下游引物(1 μmol/L)12 μl，總RNA 2 μl，2 U/μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μl，DEPC水20 μl。26℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。microRNA實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系: 2×定量PCRMaster Mix，終濃度1×，用量10 μl; miR-103b上游引物(5’-GAGCAGCATTGTACAG-3’;20 μmol/L)，終濃度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;miR-103b下游引物(5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;20 μmol/L)，終濃度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;U6上游引物(5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;20 μmol/L)，終濃度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;U6下游引物(5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;20 μmol/L)，終濃度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;cDNA模板2 μl; Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl)，用量0.4 μl; ddH2O終濃度0.05 U/μl加至20 μl。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次， 每次3個(gè)復(fù)孔。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增3次，得出Ct均值，應(yīng)用ΔΔCt相對定量法分析miR-103b表達(dá)水平的差異。2-ΔΔCt即為基因表達(dá)差異的倍數(shù)，采用相對比值來表示相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1ALL初診患者miR-103b的表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示，在ALL組患者miR-103b的相對表達(dá)量為(5.52±0.39)，明顯高于正常組的(1.22±0.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-21.13,P<0.05)。見圖1。

圖1ALL組與正常組骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR-103b的相對表達(dá)量對比(*P<0.05)

2.2不同亞型ALL初診患者miR-103的表達(dá)水平B-ALL患者(54例)與T-ALL患者(26例)miR-103b的相對表達(dá)量分別為(5.55±0.43)和(5.41±0.42)，均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.21,P<0.05;t=19.70,P<0.05)；而B-ALL與T-ALL患者之間miR-103b的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.58,P=0.58)。見圖2。

圖2B-ALL患者組、T-ALL患者組與正常人組骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR-103b的相對表達(dá)量對比(*P<0.05)

2.3miR-103b與bcr-abl融合基因表達(dá)的相關(guān)性80例ALL患者中，經(jīng)熒光定量PCR檢測呈bcr-abl(p190)融合基因陽性28例，miR-103b在bcr-abl融合基因陽性ALL患者中的表達(dá)水平(5.55±0.46)與bcr-abl融合基因陰性的ALL患者中的表達(dá)水平(5.26±0.52)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.33,P=0.19)。進(jìn)一步分析顯示，在bcr-abl融合基因陽性的ALL患者28例中，bcr-abl(p190)mRNA的相對表達(dá)水平(0.91±0.19)與miR-103b的相對表達(dá)水平(5.55±0.46)無顯著相關(guān)性(r=-0.136,P=0.49)。見圖3、4。

圖3bcr-abl融合基因陽性和bcr-abl融合基因陰性的ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR-103b的相對表達(dá)量對比

注：bcr-abl陽性組: bcr-abl融合基因陽性的ALL患者組；bcr-abl陰性組: bcr-abl融合基因陰性的ALL患者組

圖428例bcr-abl融合基因陽性的ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中miR-103b與bcr-abl融合基因表達(dá)的相關(guān)性分析

3討論

ALL發(fā)病時(shí)骨髓中異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖并抑制正常造血。對于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病，無病生存率可達(dá)80%[5]，治療效果較成人急性淋巴細(xì)胞白血病好，盡管將兒童急性淋巴細(xì)胞白血病治療經(jīng)驗(yàn)運(yùn)用于成人，可以得到較高的緩解率，旦無病生存率仍低于40%，其中bcr-abl融合基因是成人急性淋巴細(xì)胞白血病的不良預(yù)后的原因之一。在成人B-ALL中，bcr-abl融合基因陽性率達(dá)20%～40%,較bcr-abl融合基因陰性的B-ALL有更復(fù)雜的基因表達(dá)機(jī)制，對于治療也表現(xiàn)出明顯的個(gè)體化差異[6]。因此，深層次探索新的生物學(xué)標(biāo)志物，為白血病治療提供新的治療靶點(diǎn)成為一個(gè)研究的重點(diǎn)問題。

miRNA是一個(gè)小的非編碼的RNA，在腫瘤中可以作為一個(gè)癌基因后抑癌基因發(fā)揮作用。miR-103b是最近幾年才發(fā)現(xiàn)的miRNA。Luo等[7]發(fā)現(xiàn)血小板來源的miR-103b在參與二型糖尿病中葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，是診斷二型糖尿病的重要因子。學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-103b在膀胱癌和結(jié)直腸腺癌中有異常的表達(dá)，并發(fā)揮作用[8，9]。miR-103b還參與脂肪細(xì)胞的形成[10]，參與調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥過程[11]，參與抑制成骨細(xì)胞的生成[12]。但是miR-103b在ALL中的表達(dá)情況和作用筆者鮮見報(bào)道。

在本研究中，我們檢測了ALL患者miR-103b表達(dá)水平，結(jié)果顯示初診ALL患者miR-103b表達(dá)水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。但在B-ALL和T-ALL的識別方面，miR-103b在B-ALL與T-ALL患者中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，無法通過miR-103b的表達(dá)水平區(qū)分B-ALL與T-ALL。另外我們發(fā)現(xiàn)miR-103b的表達(dá)水平與bcr-abl融合基因的表達(dá)水平無相關(guān)性(P>0.05)。針對miR-103b如何調(diào)控ALL的發(fā)生，有待于通過進(jìn)一步深入研究來發(fā)現(xiàn)其調(diào)控靶基因的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究展示了在不同分型ALL患者中miR-103b的表達(dá)水平，證實(shí)miR-103b在ALL患者中較正常人群表達(dá)上調(diào)，但miR-103b的表達(dá)與ALL的免疫分型無關(guān)，且bcr-abl融合基因的表達(dá)對miR-103b在ALL中的表達(dá)無明顯影響，這些發(fā)現(xiàn)為ALL的診斷和治療提供了新的思路，具有一定的臨床意義。

參考文獻(xiàn)

1Hunger SP,Mullighan CG.Acute Lymphoblastic Leukemia in Children.N Engl J Med,2015,373:1541-1552.

2Mathieu J,Ruohola-Baker H.Regulation of stem cell populations by microRNAs.Adv Exp Med Biol,2013,786:329-351.

3Zheng RL,Jiang YJ,Wang X.Role of microRNAs on therapy resistance in Non-Hodgkin’s lymphoma.Int J Clin Exp Med,2014,7:3818-3832.

4Luan C,Yang Z,Chen B.The functional role of microRNA in acute lymphoblastic leukemia: relevance for diagnosis, differential diagnosis,prognosis,and therapy.Onco Targets Ther,2015,8:2903-2914.

5Gupta A,Kapoor G,Jain S,et al.Absolute Lymphocyte Count Recovery Independently Predicts Outcome in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia:Experience From a Tertiary Care Cancer Center of a Developing Country.J Pediatr Hematol Oncol,2015,37:e143-149.

6Tamai H,Inokuchi K.Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia.Rinsho Ketsueki,2015,56:253-260.

7Luo M,Li R,Deng X,et al.Platelet-derived miR-103b as a novel biomarker for the early diagnosis of type 2 diabetes.Acta Diabetol,2015,52: 943-949.

8Zheng G,Wang H,Zhang X,et al.Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients.PLoS One,2013,148: e83025.

9Vinall RL,Kent MS,deVere White RW.Expression of microRNAs in urinary bladder samples obtained from dogs with grossly normal bladders,inflammatory bladder disease, or transitional cell carcinoma.Am J Vet Res,2012,73: 1626-1633.

10Li M,Liu Z,Zhang Z,et al.miR-103 promotes 3T3-L1 cell adipogenesis through AKT/mTOR signal pathway with its target being MEF2D.Biol Chem,2015,396: 235-244.

11Zhang Y,Qu X,Li C,et al.miR-103/107 modulates multidrug resistance in human gastric carcinoma by downregulating Cav-1.Tumour Biol,2015,36: 2277-2285.

12Sun Z,Cao X,Hu Z,et al.MiR-103 inhibits osteoblast proliferation mainly through suppressing Cav1.2 expression in simulated microgravity.Bone,2015,76: 121-128.

Expression and significance of micro RNA-103b in patients with acute lymphoblastic leukemia

ZHANGGuojun,LIUZhuogang.

DepartmentofHematology,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Liaoning，Shenyang110022,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of micro RNA-103b (miR-103b) in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL).MethodsThe relative expression levels of miR-103b were detected by Real time PCR (qRT-PCR) in bone marrow mononuclear cells of 80 patients with ALL (patient group) and 20 healthy subjects (control group) from Shengjing Hospital of China Medical University between January 2014 and September 2014,moreover,the correlations between miR-103b expression and patients’clinical data were analyzed.ResultsThe relative expression levels of miR-103b in patient group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression levels of miR-103b between acute B-ALL and acute T-ALL (P>0.05),furthermore, there was no significant correlation between expression levels of miR-103b and bcr-abl positive rates or expression levels of bcr-abl mRNA in ALL (P>0.05).ConclusionThe miR-103b is up-regulated in patients with ALL, which may be served as potential molecule marker in diagnosis of ALL. The expressions of bcr-abl fusion gene have no obvious effects on expressions of miR-103b in patients with ALL.

【Key words】lymphoblastic leukemia,acute; bcr-abl; microRNA-103b

(收稿日期：2015-12-11)

【中圖分類號】R 733.711

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1289-03

通訊作者：劉卓剛，110022沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液內(nèi)科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.002

項(xiàng)目來源：遼寧省博士科研啟動基金項(xiàng)目(編號：20141046)

E-mail：liuzhuogang@gmail.com