曾德興楊 慧黃麗雯

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金黃色葡萄球菌鑒定及spa基因多態(tài)性分析

曾德興1楊 慧2黃麗雯3

【摘要】目的 鑒定分離自龍崗區(qū)的金黃色葡萄球菌，探討使用金黃色葡萄球菌spa基因?qū)赀M行多態(tài)性分析的價值。方法 在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找金黃色葡萄球菌spa基因序列，并設(shè)計引物進行實時熒光PCR技術(shù)分型，建立新的金黃色葡萄球菌分型方法，并與常規(guī)金黃色葡萄球菌spa基因分型和脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型法進行比較，構(gòu)建龍崗區(qū)金黃色葡萄球菌分型數(shù)據(jù)庫。結(jié)果 5例患者抗結(jié)核治療前后前鼻腔定植的金黃色葡萄球菌spa分型相同，結(jié)果與PFGE結(jié)果一致；5例患者定植的金黃色葡萄球菌spa分型分別為：t795、t179、t189、t758和t796，其中t795、t758和t796為新發(fā)現(xiàn)的分型。結(jié)論 spa分型是一個較好的金黃色葡萄球菌快速基因分型方法。

【關(guān)鍵詞】葡萄球菌；SPA；基因

1龍崗區(qū)坂田街道預防保健所，廣東深圳 518129

2龍崗區(qū)疾病預防控制中心，廣東深圳 518129

3龍崗區(qū)龍崗街道預防保健所，廣東深圳 518129

金黃色葡萄球菌又稱為嗜肉菌，是人類較重要的病原菌。由于金黃色葡萄球菌可導致院內(nèi)感染，進而影響患者的身體健康，故亟需對其進行快速及準確分型，以減少院內(nèi)感染的發(fā)生。Kumari等[1]采用脈沖場凝膠電泳對其進行分型，但是該方法的操作步驟較復雜，且所使用的設(shè)備較昂貴，難以在實驗室中普及，限制了其應用。基因多態(tài)性方法與脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型法相比，具有較好的穩(wěn)定性及重復性，且快速易用，容易得到實驗結(jié)果，以滿足實驗室的實驗要求[2]，然而目前國內(nèi)鮮有相關(guān)報道。本研究就基于金黃色葡萄球菌spa基因的多態(tài)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 選取來源于臨床、食物中毒及食品監(jiān)測處的金黃色葡萄球菌菌株10株，其中5株來源于結(jié)核病患者的鼻拭子，3株來源于食品，1株來源于食物中毒，1株來源于腹瀉標本。

1.2 檢測方法

1.2.1 spa基因分型 將各菌株置于胰酶大豆瓊脂平板接種，并過夜培養(yǎng)，將5個典型的菌落置于普通裂解液中；然后加入溶葡萄球菌素和RNA酶，使終濃度為100 μg/ml，煮沸10 min，以1000 r/min離心10 min（離心半徑為8.7 cm），將上清液作為PCR模板。根據(jù)文獻設(shè)計PCR擴增spaX區(qū)的引物：PCR反應條件：95℃預變性；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10 min，4℃保護，并在紫外光燈下觀察并記錄PCR產(chǎn)物。spa分型采用GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ridom.de/spaserver/），測序結(jié)果中所使用的重復編碼判度根據(jù)相關(guān)文獻獲得[3]。

1.2.2 PFGE ①將菌懸液與等量低熔點瓊脂糖混勻，并制作成塊；②待蛋白酶K過夜消化后，其染色體DNA的原位消化則采用Sma Ⅰ內(nèi)切酶；③使用脈沖電泳儀，型號為CHEF-Mapper，根據(jù)美國疾病控制和預防中心（CDC）TENOVER等方法判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 治療前spa基因擴增產(chǎn)物結(jié)果 5例患者治療前分離的菌株A和治療后分離的菌株B的spa基因擴增產(chǎn)物長度分別相同。

2.2 spa基因分型結(jié)果 結(jié)果可見，spa基因重復序列數(shù)為6～10個。菌株1A和1B、2A和2B、3A和3B、4A和4B、5A和5B具有相同的重復序列。分型結(jié)果為：2A和2B為t179型，3A和3B為t189型；1A和1B、4A和4B、5A和5B的spa型為新發(fā)現(xiàn)的基因型，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分別定為t795、t758 和t796型。見表1。

表1　5例患者治療前后的spa重復編碼特征、重復數(shù)長度及分型

2.3 PFGE結(jié)果 由表1可見，1A與1B的條帶相同，以此類推，2A、3A、4A、5A分別與2B、3B、4B、5B的條帶相同。5例患者治療前后所分離菌株類型是相同的，但所攜帶菌株的類型則不同。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種人畜共患病的重要致病菌，其暴發(fā)流行嚴重威脅著人類健康。減少和控制金黃色葡萄球菌感染的一個重要策略是明確流行環(huán)節(jié)，切斷傳播途徑，因此，如何選擇可靠的分型方法，對于院內(nèi)感染的控制有重要作用，但目前使用的各種金黃色葡萄球菌分型方法各有缺點。高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)是在實時熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的實時定量新技術(shù)，是目前最好的一種高通量突變掃描和基因分型技術(shù)，具有操作簡便、快速、低成本、靈敏度及特異度高、閉管操作、對樣品無污染、后期數(shù)據(jù)分析簡單、易懂等優(yōu)點；本研究擬采用HRM技術(shù)研發(fā)出針對金黃色葡萄球菌spa基因的新型分子分型方法，該項研究的最終成果將提供一種新的快速、準確、低成本的金黃色葡萄球菌分型方法。HRM技術(shù)在臨床檢驗、食品檢驗、商品檢驗等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。本課題在建立新的金黃色葡萄球菌分子分型方法的同時構(gòu)建龍崗區(qū)金黃色葡萄球菌數(shù)據(jù)庫，以實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的長期動態(tài)觀察和實時監(jiān)測，可為金黃色葡萄球菌所致食源性疾病的流行病學調(diào)查和準確溯源提供主要技術(shù)依托；通過與其他實驗室數(shù)據(jù)比較，可為金黃色葡萄球菌的監(jiān)測、預警、控制作出貢獻，有效降低金黃色葡萄球菌的社區(qū)獲得性感染和院內(nèi)感染。

蛋白A是從A型金黃色葡萄球菌中分離而得到的細胞壁蛋白，可形成含有A蛋白、抗原及抗體的復合物。蛋白A的spa基因長約為2150 bp，包括X區(qū)、Fc結(jié)合區(qū)及其C末端。其中X區(qū)中又包含2～15個重復序列，其長度大約為24 bp，有高度多態(tài)性[2,4-5]。由于spa分型的實驗結(jié)果較容易獲取及解釋，且能夠利用數(shù)據(jù)庫了解不同地區(qū)的菌株流行情況，從而為其提供實驗依據(jù)，并容易進行序列比對和分型。

綜上所述，從PFGE結(jié)果看，每例患者治療前后分離的2株菌（A和B）的條帶完全相同，雖然利福平對治療前后分離菌株的最小抑菌濃度差別明顯，但每例患者治療前后分離到的菌株來源相同。此外，spa擴增結(jié)果提示患者治療前后的菌株擴增產(chǎn)物相同，提示spa分型是一個較好的金黃色葡萄球菌快捷基因分型方法。

參考文獻

[1] Kumari DN,Keer V,Hawkey PM,et al.Comparision and application of ribosome spacer DNA amplicon polymorphisms and pulsedfield gel electrophoresis for differentiation of methi-cillin- resistant Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1997(35):881-885.

[2] Frenary HM,Bunschoten AE,Schouls LM,et al.Molecular typing of methicillin- resistant staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphisms[J].Eur J Clin Micro-biol Infect Dis,1996,(15): 60-64.

[3] 閆笑梅,陶曉霞,鄭明寰,等.北京分離株金黃色葡萄球菌基因型分析[J]中國病原生物學雜志,2009,5(5):321-324.

[4] Shopsin B,Gomez M,Montgomery SO,et al.Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1999,37(11):3556-3563.

[5] 李劍,陸菊明,潘長玉,等.瘦素受體Gln223 Arg基因多態(tài)性與不同葡萄糖耐量血清瘦素的相關(guān)性研究[J].軍醫(yī)進修學院學報,2001, 2(4):259-261.

【中圖分類號】R378.11

【文獻標志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.04.090