梁娟 呂軍影 胡謀波 鄭雪嘉

【摘 要】目的：觀察紅花水煎液對硬皮病小鼠皮膚RORγt表達的影響，探討紅花抗SSc皮膚纖維化的免疫機制。方法：將32只BALB/C小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組、紅花組，每組8只。除空白對照組外，其余3組注射博來霉素緩沖液誘導硬皮病模型，同時予生理鹽水（空白對照組和模型對照組）、醋酸潑尼松（醋酸潑尼松組）、紅花水煎液（紅花組）灌胃處理28 d。取小鼠皮膚，蘇木素-伊紅染色測真皮厚度及評價皮膚炎癥程度；免疫組化法、蛋白質印跡法檢測皮膚RORγt的蛋白表達水平。結果：各造模組小鼠皮膚均有不同程度增厚，炎性細胞浸潤，炎癥評分、RORγt蛋白表達均不同程度升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與模型對照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組小鼠真皮厚度及皮膚炎癥評分、RORγt蛋白表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義

（P < 0.05）。與醋酸潑尼松組比較，紅花組真皮厚度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），皮膚炎癥評分及RORγt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結論：紅花水煎液能降低硬皮病小鼠皮膚RORγt蛋白表達，抑制免疫炎癥反應而具有抗皮膚纖維化的治療作用。

【關鍵詞】 硬皮?。患t花；RORγt；炎癥反應；抗皮膚纖維化；小鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.04.001

Effect of Saflfower Decoction on the Expression of Skin RORγt in Mice with Scleroderma

LIANG Juan，LYU Jun-ying，HU Mou-bo，ZHENG Xue-jia

【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of safflower decoction on the expression of skin RORγt in mice with scleroderma to explore the immune mechanism of safflower for anti-SSc skin fibrosis.Methods：

32 BALB /C mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group，and a safflower group，8 rats in each group.Except for the blank control group，the other 3 groups were given injection of bleomycin damping fluid to establish scleroderma models.Meanwhile，intragastric administration was given to the control and model control groups with normal saline，to the prednisone acetate group with prednisone acetate，and to the safflower group with safflower decoction for 28 days.Hematoxylin-eosin was used to measure the thickness of skin and evaluate the degree of skin inflammation.Immunohistochemistry method and Western blot were used to detect the expression level of skin RORγt.Results：Skin of Models in each group had various degrees of thickening and inflammatory cell infiltration.Inflammation score and RORγt protein expression were increased in various degrees，and the difference was statistically significant （P < 0.05） compared with the blank control group.Compared with the control group，the dermal thickness，skin inflammation score and RORγt protein expression of the prednisone acetate group and the safflower group were decreased，and the difference was statistically significant （P < 0.05）.Compared with the prednisone acetate group，the dermal thickness of the safflower group was decreased，the difference being statistically significant （P < 0.05） and the differences of skin inflammation score and RORγt protein expression having no statistical significance （P > 0.05）.Conclusion：Safflower decoction can decrease the expression of RORγt protein expression in mice with scleroderma and suppress the immune inflammatory reaction，having a therapeutic effect on skin fibrosis.

【Keywords】 scleroderma；safflower；RORγt；inflammatory reaction；anti skin fibrosis；mice

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic scleroderma，SSc）是一種以局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟器官結締組織纖維化或硬化，最后發(fā)展至萎縮為特點的自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，本病發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)了免疫系統(tǒng)異常活化的現(xiàn)象，特別是細胞介導的免疫反應在SSc發(fā)病中占主要作用[1]。SSc患者中輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）免疫應答明顯增強，對疾病具有至關重要的作用[2]。

維甲酸相關孤兒受體γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt）被認為是Th17細胞的特異性轉錄調控因子[3]，調節(jié)白細胞介素-17（interleukin 17，

IL-17）的分泌，影響炎癥效應，通過對RORγt的抑制可阻止初始CD4+T細胞向Th17的分化，降低免疫應答反應，這對于SSc的發(fā)病機制和新干預措施的研究具有重要意義。紅花能夠抑制炎癥反應[4]，

是否可通過降低RORγt的表達而抑制Th17細胞的分化，從而達到抗炎、抗皮膚纖維化作用，目前尚未見報道。因此，本實驗通過紅花干預治療硬皮小鼠模型，觀察轉錄因子RORγt在皮膚中的表達變化，探討紅花抗SSc皮膚纖維化的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 32只BALB/C小鼠，SPF級，雌性，體質量18～22 g，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物許可證號SCXK桂2014-0002。在清潔級環(huán)境中分籠適應性飼養(yǎng)2 d后給予編號，將32只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組和紅花組，每組8只。

1.2 主要藥物 注射用鹽酸博來霉素（日本化藥株式會社，批號140372）溶于高壓滅菌的0.01 M

PBS（pH = 7.2）中，制成濃度為200 μg·mL-1

緩沖液，過濾除菌后分裝于EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆?。紅花（新疆產(chǎn)，批號140901）采用常規(guī)方法加水煎煮并濃縮成濃度為1 g·mL-1的紅花水煎液，

4 ℃保存?zhèn)溆谩４姿釢娔崴善◤V東華南藥業(yè)集團有限公司，批號141123）溶于蒸餾水中制成濃度為0.45 mg·mL-1混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。以上藥物均購于本院藥房。兔抗小鼠RORγt多克隆抗體（Abcam公司）SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉）二抗HRP標記山羊抗兔IgG（CST公司）RIPA細胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）。

1.3 模型制備及給藥 按照國內(nèi)外文獻方法[5-6]，將所有小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛剃除后皮下注射，除空白對照組注射質量分數(shù)為0.01 M PBS（pH = 7.2）

（每次0.1 mL，每日1次，共28 d）外，其余各組均注射質量分數(shù)為200 μg·mL-1的注射用鹽酸博來霉素緩沖液（每次0.1 mL，每日1次，共28 d）。造模開始即行藥物干預治療，根據(jù)小鼠與人折算系數(shù)表，計算出小鼠（體質量20 g）使用醋酸潑尼松劑量為0.09 mg·d-1，紅花劑量為30 mg·d-1。灌胃前用蒸餾水將備用藥物稀釋成相應濃度，醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松溶液0.2 mL·d-1灌胃，紅花組給予紅花水煎液0.2 mL·d-1灌胃，空白對照組和模型對照組給予等容量生理鹽水灌胃，共28 d。

2 標本制備及指標檢測

2.1 取 材 用藥結束后第2天，所有小鼠給予2 mL·kg-1腹腔注射質量分數(shù)為10%的水合氯醛麻醉。取背部皮膚，一部分放入質量分數(shù)為10%的甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)制取

4 μm切片，用于蘇木素-伊紅染色（HE染色）和免疫組化；一部分于-80 ℃保存，用于蛋白質印跡法（Western blot）測定。

2.2 真皮厚度及炎癥評分 石蠟切片行HE染色：二甲苯、酒精脫蠟至水，蘇木素浸染，質量分數(shù)為1%的鹽酸酒精分化，質量分數(shù)為0.5%的伊紅溶液復染，再脫水透明封片。在光鏡下（× 200倍）觀察皮膚炎癥情況，HE染色結果示膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色，肌纖維、纖維素和紅細胞染粉紅色、胞核染藍黑色。并采用病理圖像分析儀系統(tǒng)軟件，每只小鼠的切片隨機取5處測定真皮厚度，并按照文獻[7]的方法計算皮膚炎癥積分：0，沒有；1，少許；2，輕度；3，中度；4，重度。

2.3 免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3 min×3次，置于檸檬酸鹽緩沖溶液中進行抗原熱修復，PBS洗3 min × 3次，質量分數(shù)為3%的過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBS洗3 min × 3次，按照SP檢測試劑盒操作步驟進行檢測，一抗使用兔多克隆抗體RORγt，DAB顯色試劑盒進行顯色，封片后鏡下觀察結果，采用Olmpus圖像采集系統(tǒng)和Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進行定量分析，每張切片隨機選取5個視野（× 400倍），以細胞漿、細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測定每個視野下染色的平均光密度值（IOD）=總光密度/陽性面積。

2.4 Western blot檢測 皮膚組織剪碎后置于勻漿器中，加入RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min，高速離心后取上清液按照BCA試劑盒說明書測蛋白濃度，再加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min變性蛋白分裝后-20 ℃保存。用質量分數(shù)為10%的SDS-PAGE凝膠電泳后轉印蛋白到PVDF膜上，質量分數(shù)為5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗兔多克隆RORγt（1∶300）孵育4 ℃過夜，常溫搖床下孵育二抗。以GAPDH（1∶10000）作為內(nèi)參。ECL壓片顯影，拍照得到圖片后采用Image J軟件讀取內(nèi)參、目的蛋白條帶的積分灰度值，相對含量即為目的積分灰度值（IOD）/內(nèi)參積分灰度值（IOD）。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，如果符合正態(tài)分布和方差齊性，樣本均數(shù)的比較采用完全隨機設計的方差分析和q檢驗，否則采用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 真皮厚度及炎癥評分 小鼠皮膚HE染色顯示，空白對照組小鼠皮膚結構完整，無或有少許淋巴細胞等炎性細胞浸潤。模型對照組小鼠皮膚明顯增厚，膠原纖維明顯增生，真皮小血管周圍可見大量炎性細胞浸潤，皮膚附屬器萎縮。醋酸潑尼松組和紅花組小鼠皮膚炎癥細胞浸潤減輕，皮膚厚度降低，纖維增生緩解。與空白對照組比較，各組小鼠真皮厚度增加，炎癥評分不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型對照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組真皮厚度及炎癥評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與醋酸潑尼松組比較，紅花組真皮厚度降低，差異有統(tǒng)計學意義

（P < 0.05），皮膚炎癥評分差異無統(tǒng)計學意義

（P > 0.05）。見表1、圖1。

3.2 RORγt表達水平 免疫組化分析顯示，各組小鼠皮膚均可見陽性細胞表達，空白對照組呈弱表達。Western blot分析顯示，在蛋白相對分子量為58 kD及36 kD處可見特異性陽性條帶，分別是RORγt及GAPDH蛋白表達。與空白對照組比較，造模小鼠皮膚RORγt表達水平均增強，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與模型對照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組小鼠皮膚RORγt表達水平減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；

與醋酸潑尼松組比較，紅花組小鼠皮膚RORγt表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2、

圖2、圖3。

4 討 論

SSc也稱硬皮病，是一種以皮膚及內(nèi)臟器官（包括心、肺、腎和消化道等）進行性增厚致纖維化、硬化為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。當前研究表明，免疫系統(tǒng)的活化和失調、血管改變、結締組織代謝異常以及三者之間的相互影響是SSc的主要發(fā)病機制，其中免疫反應異常在SSc的發(fā)病中起著主導作用，是SSc血管病變和纖維化過程中的一個關鍵因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞活化在SSc的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關重要的作用。T細胞激活分泌大量的細胞因子、炎癥介質等導致內(nèi)皮細胞損傷，刺激成纖維細胞，進而導致組織器官纖維化及功能障礙[8]。

Th17細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個T細胞亞群，主要由CD4+T淋巴細胞分泌產(chǎn)生，以分泌IL-17因子為特征而不同于傳統(tǒng)的Th1和Th2細胞[9]。Th17細胞能夠介導炎性反應、清除細胞外病原菌引起的感染，尤其在人類自身免疫性疾病、炎癥反應的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]。RORγt、RORα是Th17分化過程中2種轉錄因子，調節(jié)Th17細胞分化[11]。有研究表明，在初始T細胞內(nèi)轉入編碼RORγt的逆轉錄病毒可以誘導其分化Th17細胞，分泌IL-17，相反，在RORγt基因敲除的小鼠中Th17細胞分化嚴重受損[3]，這證明了RORγt在Th17細胞分化中的重要作用，也是目前常用的檢測Th17基因轉錄的標志，可在一定程度上反應Th17細胞的水平和功能活性[12]。本實驗造模小鼠皮膚的RORγt蛋白表達及炎癥評分均升高，真皮厚度增加，說明Th17細胞參與了SSc免疫炎癥反應，通過致炎作用促進皮膚組織纖維化的形成。

近來研究表明，糖皮質激素并不是僅有免疫抑制功能，而是對機體有雙向調節(jié)作用，主要體現(xiàn)在抗炎與促炎作用以及對于免疫細胞和免疫應答過程中的不同調節(jié)作用[13]。醋酸潑尼松是臨床上廣泛應用于治療SSc的中效腎上腺皮質激素，可抑制SSc患者病理性免疫反應，對免疫過程中許多環(huán)節(jié)起抑制作用，特別是在免疫反應的早期階段發(fā)揮治療作用，但也可抑制患者自身免疫系統(tǒng)功能，產(chǎn)生多種副作用[14]。活血化瘀中藥臨床上已被廣泛應用于SSc等膠原合成異常增多性疾病的治療，它們單獨或聯(lián)合應用能不同程度改善患者癥狀。紅花是一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[15]，有研究表明，SSc患者通過使用紅花注射液治療后，雷諾氏現(xiàn)象明顯減輕，皮膚軟化，關節(jié)活動度增強[16]。對SSc患者皮膚成纖維細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)紅花能顯著促進SSc患者皮膚成纖維細胞的膠原合成[17]。而筆者前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，紅花能夠降低血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（COL-Ⅲ）的表達，具有抗纖維化作用[18-19]。本實驗通過紅花干預治療后小鼠真皮厚度、炎癥評分和皮膚組織中的RORγt蛋白均顯著下降，表明紅花可能通過抑制RORγt的表達，發(fā)揮抑制免疫炎癥反應作用，而達到抗纖維化作用。與醋酸潑尼松組比較，①紅花組小鼠炎癥評分和RORγt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），說明紅花水煎液的免疫抑制、抗炎作用與醋酸潑尼松相似；②紅花組小鼠真皮厚度降低顯著，可能與紅花抗過氧化、清除氧自由基、改善血管微循環(huán)等多靶點、多環(huán)節(jié)作用有關；③本實驗醋酸潑尼松組小鼠炎癥評分及RORγt表達均略低于紅花組，但真皮厚度減低不如紅花組，且觀察小鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，醋酸潑尼松組較紅花組小鼠活動量減少，毛發(fā)粗糙無光澤，再生較少，體質量明顯減輕。說明醋酸潑尼松抗炎作用顯著，但可引起消化道系統(tǒng)潰瘍、免疫系統(tǒng)功能降低等較強毒副作用；傳統(tǒng)中藥紅花毒副作用較小，可增強非特異性免疫功能，對抗醋酸潑尼松免疫抑制作用[20]。

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收稿日期：2015-12-14；修回日期：2016-01-18