董亞輝　宋展

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院　河南 新鄉(xiāng)　453000； 2.南陽市中心醫(yī)院 普外科　河南 南陽　473009)

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·論著·

基因芯片篩選原發(fā)性肝癌患者的差異表達(dá)基因

董亞輝1宋展2

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南 新鄉(xiāng)453000； 2.南陽市中心醫(yī)院 普外科河南 南陽473009)

【摘要】目的利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)探討原發(fā)性肝癌(PHC)不同階段(癌組織、癌旁組織、正常組織)差異基因的表達(dá)，進(jìn)一步尋找PHC不同階段組織中的差異表達(dá)基因。方法提取20例肝癌癌組織、癌旁組織和正常組織的總RNA，應(yīng)用Agilent人類全基因組4×44K基因芯片篩選差異表達(dá)基因，采用微陣列類分析(SAS)軟件對芯片圖像進(jìn)行分析。結(jié)果篩選出癌組織與正常組織差異基因4 175個，其中上調(diào)基因1 850個，下調(diào)基因2 325個。對篩選出的差異基因進(jìn)行GO分類，主要分為催化活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、蛋白運輸功能、細(xì)胞生長、凋亡等功能過程。結(jié)論利用基因芯片技術(shù)可高通量地篩選出PHC不同階段組織的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步闡明PHC的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】肝癌；基因表達(dá)譜；基因芯片

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，號稱癌癥之王，發(fā)病率逐年增長，目前已超過62.6萬/a，死亡接近60萬/a，位居惡性腫瘤死亡率的第3位。肝癌在我國高發(fā)，目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的55%[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國沿海地區(qū)肝癌的發(fā)病率高于內(nèi)地，且男性高于女性。近年來基因芯片技術(shù)在腫瘤研究中逐漸得到廣泛應(yīng)用，為我們在分子水平研究肝癌的發(fā)病機制提供了一條新途徑。本研究通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對PHC的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，通過癌組織與癌旁組織、正常組織對比，篩選差異表達(dá)基因，以尋找與肝癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因，以利于全面了解肝癌的發(fā)病機制，為肝癌的診斷和治療提供新途徑。

1資料與方法

1.1研究對象選擇南陽市中心醫(yī)院普外科2014年1月至2014年12月經(jīng)病理證實為PHC的20例住院患者，其中男15例，女5例，年齡54～76歲，中位年齡66.24歲。所有患者均有詳細(xì)的臨床資料，術(shù)前均未接受放化療，在手術(shù)和采集標(biāo)本前均簽署書面知情同意書。手術(shù)切除腫瘤后立即取新鮮組織(癌組織、癌旁組織、正常組織)，切成約1 cm小塊，PBS溶液漂洗后迅速投入液氮中保存。

1.2檢測方法

1.2.1RNA抽提和純化采用TRIZOL Reagent方法，根據(jù)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品總RNA抽提，抽提所得總RNA經(jīng)安捷倫生物分析儀電泳質(zhì)檢合格后使用RNA純化試劑盒及DNA酶消化試劑盒純化總RNA。

1.2.2樣品RNA放大和標(biāo)記樣品RNA采用安捷倫表達(dá)譜芯片配套試劑盒：快速標(biāo)記低輸入試劑盒(單色，貨號5190-2305，安捷倫科技，美國)。按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程對樣品總RNA中的mRNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用純化試劑盒(貨號74106，QIAGEN，德國)純化標(biāo)記好cRNA。

1.2.3芯片雜交使用安捷倫表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒：基因表達(dá)雜交試劑盒(貨號5188-5242，安捷倫科技，美國)在滾動雜交爐(貨號2545A，安捷倫科技，美國)中滾動雜交17 h(65 ℃，10 rpm)，雜交cRNA，并在洗缸中洗片，所用試劑為基因表達(dá)的洗滌液套裝(貨號5188-5327，安捷倫科技，美國)。

1.2.4結(jié)果掃描采用安捷倫微陣列掃描儀軟件對完成雜交的芯片進(jìn)行掃描，用Feature Extraction software軟件讀取數(shù)據(jù)，Gene Spring Software 11.0進(jìn)行歸一化處理。

1.2.5生物信息學(xué)分析用上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供的在線分析軟件SAS進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[3-5]，最后將篩選出來的差異基因進(jìn)行基本信息注釋、Gene Ontology(GO)分析、找出基因相對應(yīng)的通路，并對以上資料進(jìn)行歸納、整理和分析。

2結(jié)果

A260/A280比值是一種檢測RNA純度的方法，正常范圍為1.8～2.1。本樣品A260/A280比值為1.87～2.18，說明總RNA的純度較高。本樣品均符合以上質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。

通過SAS軟件，將20例肝癌癌組織和正常組織表達(dá)譜進(jìn)行組間比較，以P-values<0.01和Fold Change>2或<0.5標(biāo)準(zhǔn)篩選出癌組織與正常組織差異基因4 175個，其中有1 850個上調(diào)基因，2 325個下調(diào)基因；以Fold Change>10或<0.1標(biāo)準(zhǔn)篩選出癌組織與正常組織顯著差異基因39個，其中有28個上調(diào)基因(表1)，11個下調(diào)基因(表2)。

對篩選出的癌組織與正常組織差異基因進(jìn)行GO分類，其中數(shù)據(jù)庫(Gene Bank)中存在的已知基因3 471個。GO分類將3 471個已知基因按分子功能(molecular function，MF)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這些有差異表達(dá)的基因與分子轉(zhuǎn)運、結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)、蛋白運輸?shù)扔嘘P(guān)。

表1　顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因

表2　顯著下調(diào)的差異表達(dá)基因

對表達(dá)顯著的29個差異基因的信號通路分析后發(fā)現(xiàn)，與上述分析的信號傳導(dǎo)通路有所不同，其主要傳導(dǎo)通路為Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)、MAPK signaling pathway和Calcium signaling pathwaym，并分析了表達(dá)顯著的29個差異基因在通路中涉及到的作用主要為細(xì)胞發(fā)育、免疫系統(tǒng)、信號分子與互動、細(xì)胞復(fù)制和修復(fù)、炎癥反應(yīng)等。

3討論

目前，肝癌的病因及發(fā)病機制尚不明確，而且尚未找到與肝癌相關(guān)的特異性分子，給預(yù)防和治療帶來了很大困難，發(fā)病率和死亡率居高不下。過去對PHC的發(fā)病機制研究往往針對1個或幾個基因，由于免疫組化、Southern、Northern等雜交技術(shù)無法滿足大規(guī)模、高通量的雜交要求，所以高通量基因表達(dá)譜芯片是目前篩選特定腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等病理過程所有基因表達(dá)最有效的方法。

本研究使用人類全基因組表達(dá)譜芯片對PHC癌組織、癌旁組織和正常組織進(jìn)行檢測，通過對其基因表達(dá)差異分析，尋找相關(guān)差異表達(dá)基因。篩選出相關(guān)差異表達(dá)基因4 175個，其中有1 850個上調(diào)基因(顯著上調(diào)28個)，2 325個下調(diào)基因(顯著下調(diào)11個)。這些基因功能涉及到了細(xì)胞生命的各個方面，數(shù)千個上調(diào)和下調(diào)基因參與了PHC的癌變過程，其中功能未詳?shù)幕蛞矃⑴c了這一過程，而差異表達(dá)顯著的基因很有可能是在調(diào)控PHC的臨床生物學(xué)方面起到了主導(dǎo)作用。

通過本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在PHC中存在大量差異表達(dá)基因，這些差異基因中有許多已經(jīng)被證實和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)系，同時也發(fā)現(xiàn)許多新的異常表達(dá)基因，而這些異常表達(dá)的基因參與了多種分子生物學(xué)過程。它們之間相互影響，有著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并在惡性腫瘤的不同時期發(fā)揮著不同的作用，使得細(xì)胞的增殖、分化、凋亡發(fā)生轉(zhuǎn)變。這也說明了肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素的過程，雖然涉及到許多基因，但其中相當(dāng)一部分可能是繼發(fā)性改變，所以只有進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵的基因或信號通路，才有可能為疾病的診斷、治療提供有效的指導(dǎo)，但是從基因到蛋白質(zhì)要通過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾才有活性，所以還需要將兩者相結(jié)合，才能更加準(zhǔn)確地闡釋完整的病理過程[6]。

參考文獻(xiàn)

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[6]岳靜宇.不同證候食管癌差異表達(dá)基因研究[D].鄭州:河南中醫(yī)學(xué)院,2012.

Screening differential expression genes of primary hepatocellular carcinoma patients by gene chip technology

Dong Yahui1，Song Zhan2

(1.XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453000,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,NanyangCentralHospital,Nanyang473090,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the related gene expression in hepatic carcinoma of different stages (cancerous tissue, paraneoplastic tissue, normal tissue) by cDNA expression profiling microarray technique, and to further seek differentially expressed genes of hepatocellular carcinoma tissue in different stages. MethodsThe whole RNA of 20 cases of cancerous tissue, paraneoplastic tissue, normal tissue of hepatic carcinoma was extracted. Agilent human genome 4×44K gene chip was applied to screen differentially expressed genes, and microarray analysis software (SAS software) was used to analyze chip image. Results4 175 kinds of differentially expressed genes of cancerous tissue and normal mucosa tissue were screened, among which, there were 1 850 kinds of up-regulated genes and 2 325 kinds of down-regulated genes. Then through GO classification, screened differentially expressed genes mainly were divided into the following function and process: catalytic activity, signal transduction, enzymatic activity regulation, transcription activity regulation, protein transportation function, cell growth and apoptosis, and so on. ConclusionGene chip technology can high-throughput screen differentially expressed genes of hepatocellular carcinoma in different stages, and provide experimental basis for further expounding the occurrence mechanism of hepatocellular carcinoma.

【Key words】hepatic carcinoma; gene expression profiling; gene chip

(收稿日期：2015-11-06)

【中圖分類號】R 735.7

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.003

通訊作者：宋展，E-mail：songzhanny@163.com。