陳桂林，翁春梅， 劉廣軍，杜貫濤(常州市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 常州　213003)

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氨溴索對(duì)大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響Δ

陳桂林*，翁春梅#， 劉廣軍，杜貫濤(常州市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 常州213003)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.03.032

摘要目的：建立測(cè)定大鼠肺組織中氟康唑的高效液相色譜-紫外吸收檢測(cè)(HPLC-UV)法，探討氨溴索對(duì)大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響。方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B組，每組各10只，A組大鼠首日經(jīng)尾靜脈給予72 mg/kg注射用氟康唑，以后給予1日36 mg/kg；B組大鼠先經(jīng)胃灌注給予6 mg/kg氨溴索，1日2次，上午給予氨溴索30 min后給予注射用氟康唑。連續(xù)給藥2 d后，第3日給予氟康唑后2 h對(duì)大鼠頸靜脈取血后解剖，取肺組織備用。采用HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定最后一次使用氟康唑后2 h大鼠的肺組織濃度。結(jié)果：氟康唑線(xiàn)性范圍均為2.5～80 μg/ml之間，回歸方程為X=0.052C-0.027 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。A組大鼠肺組織氟康唑的濃度(28.1±19.6)μg/ml，B組為(26.6±17.7)μg/ml，2組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：氨溴索對(duì)肺組織中的氟康唑藥物濃度無(wú)顯著影響，但尚需結(jié)合臨床實(shí)際行進(jìn)一步的研究。

關(guān)鍵詞氟康唑； 氨溴索； 藥物濃度； 高效液相色譜一紫外吸收檢測(cè)法

Effects of Ambroxol on Concentration of Fluconazole in Rat Lung TissueΔ

CHEN Guilin, WENG Chunmei, LIU Guangjun, DU Guantao (Dept.of Pharmacy, Changzhou the Second People’s Hospital, Jiangsu Changzhou 213003, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a HPLC-UC method of fluconazole and explore effects of ambroxol on concentration of fluconazole in rat lung tissue. METHODS: Rats were divided into group A and group B via the random number table, with 10 cases in each. And group A were treated with 72 mg/kg fluconazole injection by caudal vein in the first day, followed by 36 mg/kg for a day during the latter treatment. Group B received 6 mg/kg ambroxol by abomasum infusion, twice a day, and after the administration of ambroxol for 30 min in the morning, fluconazole injection was given. After administration of 2 d, 2 h after administration of fluconazole in the 3rdday, the blood was drawn from jugular vein of rats and then anatomy was conducted, lung tissue of rats were taken. HPLC-UV method was adopted to determine the concentration of rat lung tissue 2 hours after injecting fluconazole in the last administration. RESULTS: The calibration curve was linear with the logarithm of concentration range of 2.5～80 μg/ml of fluconazole ,he linear equation wasX=0.052C-0.027 6, the correlation coefficientr=0.999 9.The concentration of fluconazole in the lung tissue of group A was(28.1±19.6)μg/ml, and in group B was(26.6±17.7)μg/ml, the difference was not statistically significant(P<0.05). CONCLUSIONS: Ambroxol has no significant effect on concentration of fluconazole in the lung tissue, yet it still needs the further research combined with the clinical practice.

KEYWORDSFluconazole; Ambroxol; Drug concentration; HPLC-UC method

近年來(lái)，由于大劑量廣譜抗菌藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用及造血干細(xì)胞移植、實(shí)體器官移植的廣泛開(kāi)展，侵襲性肺部真菌感染的發(fā)病率明顯上升。目前，已知侵襲性肺部真菌感染最常見(jiàn)的致病菌為念珠菌，初始治療時(shí)首選氟康唑[1]。然而，氟康唑的廣泛使用導(dǎo)致了白念珠菌耐藥性的逐年增加[2-3]。有報(bào)道稱(chēng)，氨溴索能明顯增加氨芐西林、阿莫西林、紅霉素等多種抗菌藥物在肺組織中的藥物濃度[4]，臨床常見(jiàn)氟康唑與氨溴索聯(lián)合使用，但至今無(wú)氨溴索對(duì)氟康唑在肺組織中藥物濃度影響的報(bào)道。本研究以大鼠作為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定大鼠肺組織中氟康唑的濃度，探討氨溴索對(duì)氟康唑肺轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料

1.1儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，包括waters2695泵，2487紫外檢測(cè)器，Empower 2工作站(美國(guó)waters公司)； N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司)；Allegra.TM. 21R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；Milli-Q純水機(jī)(美國(guó)Mllipore公司)；XH-C型旋渦混合器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))。

1.2藥品與試劑

氟康唑?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100314-200503)。非那西丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100095-200204)；氨溴索片(常州市第四制藥廠(chǎng)，規(guī)格：30 mg，批號(hào)：20110524)；注射用氟康唑(山東羅欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1106231，規(guī)格：0.1 g) 乙腈為色譜純；冰醋酸、氨水為分析純，水為超純水。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康SD大鼠，提質(zhì)量220～240 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(蘇)2002-0031。

1.4方法

1.4.1色譜條件:色譜柱 MERCK Purospher C18(4.6×150 mm，5 μm)，Phenomenex ODS 預(yù)柱(4 mm×3 mm)；流動(dòng)相為0.02 5mol/L，磷酸二氫鉀緩沖液(三乙胺調(diào)節(jié)pH為6.1)∶乙腈=(V∶V=75∶25)，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流速1 ml/min，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20μl。

1.4.2藥物制備:精密稱(chēng)取氟康唑10.0 mg置于25 ml容量瓶中，加甲醇，即得400μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)物非那西丁10.0 mg 置10 ml容量瓶中，加甲醇搖勻，即得1 000μg/ml的儲(chǔ)備液，兩種儲(chǔ)備液同置4 ℃冰箱中保存。

1.4.3樣品處理：精密吸取2 ml肺組織勻漿于5 ml離心管內(nèi)，加入8 μg/ml非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，渦旋混勻15 s，加入4 ml乙酸乙酯，渦旋震蕩2 min，4 000 r/min離

心10 min，取上清液3 ml于10 ml尖底試管內(nèi)，40 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?50 μl流動(dòng)相溶解，取20μl進(jìn)行高效液相測(cè)定。

1.5動(dòng)物模型

取大鼠20只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B組各10只。A組大鼠首日經(jīng)尾靜脈給予72 mg/kg注射用氟康唑，以后每日給予36 mg/kg；B組大鼠先經(jīng)胃灌注給予6 mg/kg氨溴索，1日2次，上午給予氨溴索30 min后給予注射用氟康唑(氟康唑給藥劑量及方法同A組)。連續(xù)給藥2 d后，第3日給予氟康唑后2 h，對(duì)A、B兩組大鼠頸靜脈取血后解剖，取肺組織備用。取肺組織的方法：術(shù)前在大鼠腹腔注射10%水合氯醛30 mg/kg，待大鼠麻醉后固定四肢，仰臥位固定于操作臺(tái)上。打開(kāi)胸腔，心臟穿刺放血處死，然后結(jié)扎右側(cè)肺門(mén)，取大鼠右肺，用冰冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗3次，洗去凝血塊，用濾紙吸干后稱(chēng)質(zhì)量，按質(zhì)量(W)/體積(V)=1/10的比例加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液，置于超聲粉碎器中15 min，制成10%肺組織勻漿，4層紗布過(guò)濾后，取組織勻漿液保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1方法專(zhuān)屬性

在上述色譜條件(1.4.1)下，氟康唑、非那西丁分離后所得色譜圖見(jiàn)圖1。

A 空白肺組織；B 空白肺組織+氟康唑+非那西?。籆 肺組織樣品(1-氟康唑；2-非那西丁)A Blank lung tissue; B Blank lung tissue+Fluconazole+phenacetin; C Lung tissue sample(1-Fluconazole；2-Phenacetin)圖1　大鼠肺組織高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms of rat lung tissue

2.2線(xiàn)性關(guān)系及靈敏度試驗(yàn)

在離心管中精密加入20 μl不同濃度的氟康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液(8μg/ml)20μl，再加入空白肺組織勻漿2 ml，使氟康唑的濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/ml的系列樣品，然后操作，進(jìn)樣后記錄樣品峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積，算出比值X，以濃度C對(duì)比值X作加權(quán)直線(xiàn)回歸計(jì)算，得出氟康唑的回歸方程為X=0.052C-0.027 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；線(xiàn)性范圍均為2.5～80 μg/ml之間。氟康唑檢測(cè)限為0.2 μg/ml。

2.3回收率試驗(yàn)

制備含氟康唑及內(nèi)標(biāo)的混合肺組織樣品，濃度分別為2.5、10.0、80.0 μg/ml，按操作，分別記錄氟康唑峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值X，代入回歸方程，計(jì)算方法回收率(以測(cè)得量與加入量的比值計(jì)算回收率)，樣品絕對(duì)回收率，以及日內(nèi)變異和5 d內(nèi)的日間變異結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備5份濃度為10.0 μg/ml的氟康唑的肺組織樣品，冰箱冷藏5 d，按“1.4.3”項(xiàng)下處理樣品，測(cè)定肺組織中藥物濃度，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果氟康唑相對(duì)偏差<6%，未發(fā)生明顯降解。

Tab 1Recovery rate and result of precision experiment

濃度(μg/ml)方法回收率/%萃取回收率/%日內(nèi)精密度RSD/%日間精密度RSD/%2.5108.4±6.176.8±5.96.07.710.0102.4±2.579.1±3.93.45.780.099.6±3.279.3±2.13.83.3

2.5檢測(cè)結(jié)果

對(duì)處理過(guò)的肺組織進(jìn)行濃度測(cè)定后可見(jiàn)，A組大鼠氟康唑的肺組織濃度為(28.1±19.6) μg/ml，B組為(26.6±17.7) μg/ml，2組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Tab 2Determination result of fluconazole in lung tissue

組別12345678910肺組織濃度A組20.928.521.018.632.129.431.027.329.727.626.6±17.7B組22.828.620.124.532.824.630.025.934.837.028.1±19.6

3討論

3.1大鼠肺組織中氟康唑的測(cè)定方法的建立

因氟康唑和非那西丁二者分離度良好且能夠與雜質(zhì)峰分離，系統(tǒng)理論板數(shù)較高。研究結(jié)果表明，用乙酸乙酯作為提取溶劑，峰形較好，且雜質(zhì)不干擾樣品峰，回收率可達(dá)70%以上[5]。因此，本研究將其選為內(nèi)標(biāo)。建立測(cè)定大鼠肺組織中氟康唑的HPLC-UV法，以探討氨溴索對(duì)大鼠肺組織中氟康唑藥物濃度的影響。

3.2氨溴索對(duì)氟康唑藥物濃度的影響

真菌感染的死亡率較高，早期診斷和治療對(duì)患者的預(yù)后具有重要意義。臨床上常用的治療藥物主要為氟康唑、氟胞嘧啶和兩性霉素B等[6-7]。氟康唑是雙三唑類(lèi)真菌感染治療藥，可抑制麥角固醇的合成，增加真菌細(xì)胞膜的通透性，使真菌死亡達(dá)到治療效果[8-10]。相關(guān)研究結(jié)果認(rèn)為，抗菌藥物在細(xì)菌感染部位組織中的濃度是決定藥物療效的主要因素，在選擇敏感性抗菌藥物的同時(shí)，提高其在肺內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，尤其是感染灶中藥物濃度是決定臨床療效的關(guān)鍵[11]。

氨溴索是臨床上安全、有效的鎮(zhèn)咳祛痰藥，具有黏液溶解作用，可有效緩解呼吸道疾病的臨床癥狀；此外，氨溴索還可促進(jìn)支氣管纖毛上皮的再生和功能恢復(fù)；刺激肺泡Ⅱ型細(xì)胞合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)，防止肺泡萎縮和肺不張[12]。氨溴索還可增加抗菌藥物在肺組織及其分泌物質(zhì)中的濃度，提高抗菌療效[13]。楊常菀等[14]和張志新等[15]研究結(jié)果表明，氨溴索可以增加利福平在大鼠肺組織中的濃度，并且認(rèn)為氨溴索對(duì)抗菌藥物肺轉(zhuǎn)運(yùn)的影響是非特異性的。氨溴索增加抗菌藥物肺組織濃度的原因尚不明確，可能與氨溴索能夠增強(qiáng)肺組織及呼吸道中的多種細(xì)胞活性，增強(qiáng)其化學(xué)驅(qū)化反應(yīng)有關(guān)[16-17]。目前，臨床治療肺部疾病及真菌感染時(shí)常聯(lián)合應(yīng)用氨溴索和氟康唑，以達(dá)到治療效果。但氨溴索能否增加肺組織中氟康唑的藥物濃度仍不明確。本研究檢測(cè)了SD大鼠肺組織中氟康唑的藥物濃度，結(jié)果顯示，A組大鼠肺組織濃度為(28.1±19.6)μg/ml，B組為(26.6±17.7) μg/ml，2組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明氨溴索對(duì)大鼠肺組織中氟康唑的濃度影響很小。

綜上所述，氨溴索可能不會(huì)增加氟康唑在大鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而增加氟康唑在肺組織中的濃度，也可能不會(huì)增強(qiáng)其抗真菌效力，原因可能與氟康唑表觀(guān)分布容積接近于體內(nèi)水的總量，血漿蛋白結(jié)合率很低(約為11%～12%)，能良好地透入全身體液，在肺組織中的濃度接近血藥濃度等因素所致。但尚需結(jié)合臨床實(shí)際進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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(收稿日期：2015-07-24)

中圖分類(lèi)號(hào)R965.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1672-2124(2016)03-0366-03

#通信作者：主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：chunmeiweng@sina.com

Δ基金項(xiàng)目：常州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(NO.CS20109012)

*主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail: chenguilin@126.com