樊成虎，唐曉棟，肖正軍，蘭曉飛

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

VEGF在脊髓型頸椎病動(dòng)物模型椎間盤組織中的表達(dá)及意義*

樊成虎1，唐曉棟1，肖正軍2，蘭曉飛2

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

目的：探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在脊髓型頸椎病動(dòng)物模型椎間盤組織中的表達(dá)及意義。方法：將脊髓型頸椎病大鼠模型中取得的椎間盤組織（造模組）進(jìn)行HE染色及VEGF免疫組化檢測(cè)，并與正常組作對(duì)照分析。結(jié)果：造模組大鼠頸椎間盤中髓核和纖維環(huán)VEGF的含量為74.10%和5.72%，分別高于對(duì)照組大鼠的28.40%和4.70%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：脊髓型頸椎病病變椎間盤內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF，提示VEGF可能通過(guò)促進(jìn)新生血管的發(fā)生、發(fā)展，在退變的椎間盤組織中發(fā)揮作用。

脊髓型頸椎??；組織學(xué)；免疫組織化學(xué)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

頸椎病是一種臨床常見(jiàn)病，一般分型為局部型、神經(jīng)根型、椎動(dòng)脈型、脊髓型、交感型、混合型、食管壓迫型等。其中脊髓型頸椎病(Cervical Spondylotic Myelopathy，CSM)約占頸椎病分型的10～15%。其早期多以隱匿侵襲形式發(fā)展，容易漏診、誤診，后期致殘率高［1］。一般認(rèn)為形成脊髓型頸椎病的主要原因是頸脊髓、附屬結(jié)構(gòu)、血管受到來(lái)源于頸椎間盤退變、后凸、黃韌帶增生肥厚、鈣化，椎體骨贅增生等壓迫或刺激所致。

正常椎間盤是一個(gè)無(wú)血管的組織，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要是通過(guò)兩個(gè)途徑被動(dòng)擴(kuò)散，一是終板途徑，即椎體內(nèi)血管的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)骨髓腔血竇-軟骨終板界面擴(kuò)散到椎間盤，營(yíng)養(yǎng)髓核與纖維環(huán)內(nèi)層，是椎間盤主要的營(yíng)養(yǎng)途徑；二是纖維環(huán)途徑，即纖維環(huán)表面血管營(yíng)養(yǎng)纖維環(huán)外層口［2］。突出的椎間盤進(jìn)入硬膜外腔后其碎片主要特征是邊緣區(qū)域有血管形成和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。髓核穿破后縱韌帶進(jìn)入硬膜外腔后成為機(jī)體抗原，誘導(dǎo)以血管反應(yīng)為中心的免疫性炎癥，硬膜外腔小血管爬行長(zhǎng)入，單核、巨噬細(xì)胞系統(tǒng)通過(guò)新生毛細(xì)血管網(wǎng)侵入到突出的椎間盤組織內(nèi)，它們釋放各種蛋白水解酶，分解髓核組織［3］。在椎間盤退變中可見(jiàn)新生血管生成的表現(xiàn)。有研究［4］發(fā)現(xiàn)血管形成、生長(zhǎng)與許多細(xì)胞因子相關(guān)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是其中一種重要的血管生長(zhǎng)刺激因子［5］。陳飛等［6］研究表明退變椎間盤組織中有VEGF的表達(dá)，且VEGF的表達(dá)與退變程度呈正比。本研究通過(guò)動(dòng)物造模法復(fù)制脊髓型頸椎病模型，并采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)并探討VEGF在其中的表達(dá)和意義。

1 材料與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)采用植骨法復(fù)制大鼠脊髓型頸椎病(CSM)模型。選用健康雄性SPF級(jí)6月齡Wistar大鼠60只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘) 2011-0001，體質(zhì)量(250±20)g，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，以隨機(jī)數(shù)字表法抽取20只為正常對(duì)照組，其余40只為CSM造模組。從造模組中選取造模成功的20只大鼠稱重，按體質(zhì)量編號(hào)，并依照隨機(jī)數(shù)字表法分組。

1.2 方法1)采用HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；2)免疫組織化學(xué)法(SABC法)檢驗(yàn)HIF-lα、VEGF的表達(dá)情況。3)免疫反應(yīng)切片在BX60F／PM30-3型顯微照相系統(tǒng)下觀察并攝像。4)圖片應(yīng)用彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫反應(yīng)產(chǎn)物顯微圖像分析，得出平均光密度值和積分平均光密度值。

1.3 觀察指標(biāo)1)HE染色觀察其中有無(wú)血管組織浸潤(rùn)，椎間盤組織中軟骨細(xì)胞是否增生，纖維板狀結(jié)構(gòu)有無(wú)破壞，基質(zhì)是否增生，以確定是否有退變。2)VEGF免疫組化染色中胞漿或胞膜中出現(xiàn)紅色顆粒判斷為VEGF陽(yáng)性細(xì)胞。如果陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)＞5%判斷為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

1)對(duì)照組椎間盤組織基質(zhì)少見(jiàn)，軟骨細(xì)胞呈紡鍾形，無(wú)血管組織浸潤(rùn)；而造模組椎間盤組織表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞增生，纖維細(xì)胞基質(zhì)合成增多，纖維環(huán)板層狀結(jié)構(gòu)破壞，見(jiàn)圖1—2。2)VEGF的表達(dá)：在造模組和對(duì)照組中均可見(jiàn)VEDF的陽(yáng)性表達(dá)。造模組大鼠頸椎間盤中髓核VEGF的含量為74.10%，高于對(duì)照組大鼠的28.40%，造模組大鼠頸椎間盤中纖維環(huán)VEGF的含量為5.72%，高于對(duì)照組4.70%，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 造模組椎間盤組織呈現(xiàn)退變、炎性樣改變(100×)

圖2 免疫組化染色中胞漿中VEGF陽(yáng)性細(xì)胞(100×)

3 討論

人VEGF蛋白由美國(guó)科學(xué)家于1989年成功純化與鑒定。VEGF早期亦稱作血管通透因子(VPF)，是由2條相對(duì)分子質(zhì)量各為24 000的單鏈，以二硫鍵組成的高度保守的同源二聚體糖蛋白。VEGF mRNA剪切方式不同，故可產(chǎn)生VEGFl21、VEGFl45、VEGFl48、VEGFl65、VEGFl83、VEGFl89和VEG206等7種蛋白形式［7］。作為一類多功能細(xì)胞因子，VEGF通過(guò)與受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用。其生物學(xué)活性可表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)。1)促血管發(fā)生、生成和成熟VEGF是血管形成的中心調(diào)控者，在生理及病理性血管生成中起著至關(guān)重要的作用。Mattar等［8］發(fā)現(xiàn)，在重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBⅧ)-2基礎(chǔ)上加入VEGF后血管生成數(shù)量(毛細(xì)血管密度)明顯高于未加入組(單純r(jià)hBMP-2)，說(shuō)明VEGF促血管生成和發(fā)生的作用是明確的。2)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的作用EGF可改變細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，使其利于細(xì)胞生長(zhǎng)；同時(shí)在ECM的基礎(chǔ)上，VEGF可發(fā)揮更強(qiáng)的促血管生成和發(fā)育的作用。3)增加血管通透性，Murata等［9］在研究大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變模型時(shí)發(fā)現(xiàn)模型中VEGF的免疫反應(yīng)性明顯增高，血管周圍尤其明顯，并在血管周圍檢測(cè)到外滲的白蛋白，說(shuō)明VEGF可增加血管通透性。4)維持血管功能。VEGF通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)一氧化氮分泌，起到維持血管功能的作用。5)參與調(diào)節(jié)促進(jìn)骨生成，VEGF在脊髓型頸椎病退變的椎間盤內(nèi)表達(dá)呈陽(yáng)性。Liu XW等［10］對(duì)觀察組78只SD大鼠構(gòu)建椎間盤退變模型，3個(gè)月后與對(duì)照組(8只正常SD大鼠)比較VEGF陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果觀察組VEGF陽(yáng)性率分別為74.4%，其中毛細(xì)血管滲透率達(dá)62.8%，均較對(duì)照組高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。孫小航等［11］觀察不同月齡新西蘭大白兔椎間盤組織中VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著月齡的增加，椎間盤中各組織結(jié)構(gòu)成分發(fā)生從生長(zhǎng)、成熟到退變的相應(yīng)變化。VEGF和bFGF的表達(dá)都經(jīng)歷了從有到無(wú)、再?gòu)臒o(wú)到有的變化，他們的表達(dá)強(qiáng)度也都隨著月齡從強(qiáng)到弱、再?gòu)娜醯綇?qiáng)；并且VEGF和bFGF的表達(dá)和椎間盤組織結(jié)構(gòu)的變化具有相似性。VEGF在不同時(shí)期和狀態(tài)時(shí)在椎間盤中的表達(dá)提示它在椎間盤發(fā)育、成熟和退變過(guò)程中可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。龍厚清等［12］發(fā)現(xiàn)胎兒椎間盤脊索細(xì)胞和纖維環(huán)外層血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性免疫染色，陽(yáng)性率達(dá)87.5%，生長(zhǎng)期和成人期椎間盤未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；退變突出組總陽(yáng)性率為83.3%，VEGF表達(dá)主要出現(xiàn)于破裂型和游離型椎間盤突出(P＜0.01)，提示胎兒期和破裂型(包括游離型)突出椎間盤組織可產(chǎn)生內(nèi)源性VEGF，且對(duì)VEGF進(jìn)行了定量，充分說(shuō)明突出椎間盤中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)與病程、突出類型密切相關(guān)。

綜上所述，VEGF在椎間盤中的高表達(dá)，標(biāo)志著椎間盤退變的開(kāi)始，并可誘導(dǎo)和加速椎間盤的退變。且在此過(guò)程中，VEGF均與血管浸潤(rùn)及椎間盤退變程度呈正相關(guān)。因此有觀點(diǎn)認(rèn)為，椎間盤的微環(huán)境中細(xì)胞因子的相互作用，表現(xiàn)為一個(gè)復(fù)雜的、立體的、多元的關(guān)系結(jié)構(gòu)，而VEGF可能是其中關(guān)鍵作用點(diǎn)之一。退變頸椎間盤組織中VEGF的表達(dá)與突出類型相關(guān)，VEGF可能在抑制椎間盤的退變中發(fā)揮重要作用。HIF-lα和VEGF共同參與了椎間盤退變；HIF-lα可能通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)來(lái)促進(jìn)椎間盤組織中新生血管的形成，進(jìn)而延緩椎間盤退變的發(fā)生。但二者的協(xié)同機(jī)制需進(jìn)一步完善研究。通過(guò)調(diào)節(jié)二者的活性防治椎間盤退變，對(duì)治療脊髓型頸椎病提供了新的思路。

［1］ 張琥.脊髓型頸椎病脊髓慢性壓迫損傷的病理機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)信息，2011，24(3)：1113-1115．

［2］ Jiang BH，Zheng JZ，Leung S W，et al.Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor lalpha.modulation of transcriptional activity by oxygen tension［M］.J Biol Chem，1997，272(31)：19253-19260.

［3］ Ito T，Yamada M，Ikuta F，et al.Histologic evidence of absorption of sequestration-type herniated disc［J］. Spine，1996，21(2)：230-234.

［4］ Kaapa E，Hon X，Hdm S，et al.collagen synthesis and types Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，lollagens in an animal model of disc egeneration［J］.spine，1995，20(1)：59-67.

［5］ Wizgmann VS，Plate KH.Pathologv，genetics and cell biology of heman-gioblastomas［J］.Histol Histopathol，1996，11(4)：1049-1061.

［6］ 陳飛，李康華，呂國(guó)華.突出腰椎間盤組織VEGF的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)醫(yī)師雜志，2005，7(l0)：1314-1316.

［7］ W11ittle C，Gillespie K，Harrison R，et a1.Heterogeneous vascular endothelial growth factor(VEGF) isoform mRNA and receptor mRNA expression in human glomeruli，and the identification of VEGF148 mRNA，a novel truncated splice variant［J］.Clin Sci(Lond)，1999，97(3)：303-312．

［8］ Mattar T，F(xiàn)riedrich PF，Bishop AT.Effect of rhBMP-2 and VEGF in avascularized bone allotransplant experimental model based on surgical neoangiogenesis［J］. J Orthop Res，2013，31(4)：561-566．

［9］ Murata T，Ishibashi T，Khalil，et a1.Vascular endothelial growth factor plays a role in hyperpermeability of diabetic retinal vessels［J］.J Ophthalmic Res，1995，27(1)：48-52．

［10］Liu XW，Kang J，F(xiàn)an XD，et a1.Expression and significance of VEGF and p53 in rat degenraitve intervertebral disk tissues［J］.A Sian Pac J Trop Med，2013，6(5)：404-406．

［11］孫小航，范清宇，鄧迎春，等.不同月齡兔椎間盤組織中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子［J］.中國(guó)脊柱脊髓雜志，2009，19(2)：143-146.

［12］龍厚清，李佛保，胡有谷，等.腰椎間盤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)脊柱脊髓雜志，2002，12(4)：280-282.

Expression and Meaning of VEGF in Intervertebral Disc Tissue of Animal Model with Cervical Spondylotic Myelopathy

FAN Chenghu1,TANG Xiaodong1,XIAO Zhengjun2,LAN Xiaofei2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

B

1004-6852(2016)11-0132-03

2016-01-17

蘭州市科技局項(xiàng)目(編號(hào)2011-2-35)。

樊成虎(1963—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師。研究方向：脊柱脊髓相關(guān)疾病的診治。