劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

COPD模型大鼠氣道黏液高分泌機(jī)制及健脾益肺化痰方干預(yù)作用*

劉 娟，鐘相根，鄧秀蘭△，李 配，齊明月，趙娜妹

北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

目的：觀察健脾益肺化痰系列方對(duì)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)模型大鼠的防治作用及其機(jī)制。方法：采用單純香煙煙熏法建立COPD大鼠模型。將60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組，每組10只。健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組和羧甲司坦組大鼠分別給予相應(yīng)的藥物灌胃治療，正常組和模型組灌胃等體積純凈水。用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白5B(MUC5B)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、環(huán)氧化酶2(COX2)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、前列腺素E2(PGE2)的含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液(BALF)中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2含量均降低(P＜0.05)。結(jié)論：健脾益肺化痰系列方中以標(biāo)本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，能降低COPD模型大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量，抑制氣道黏液高分泌傳導(dǎo)通路，使氣道結(jié)構(gòu)重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。

COPD；氣道黏液高分泌；標(biāo)本兼治；健脾益肺化痰系列方

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的慢性疾病，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，同時(shí)氣道黏液高分泌是其重要的病理生理特征，可加重氣道阻塞，并致下呼吸道感染難以控制，已被認(rèn)為是影響COPD病死率和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。氣管、支氣管杯狀細(xì)胞化生是黏蛋白的主要來源，也是黏液過度分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究顯示［2］，黏蛋白5AC(MUC5AC)、黏蛋白C5B(MUC5B)是構(gòu)成黏液的主要低聚物黏蛋白，在COPD患者中表達(dá)明顯增加，MUC5AC存在于氣道上皮杯狀細(xì)胞，MUC5B存在于黏膜下腺體。研究表明［3-4］參與COPD對(duì)黏液分泌有作用的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)有IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17，以 及TNF-α、EGF、前列腺素、白三烯等，且它們之間存在協(xié)同效應(yīng)。目前認(rèn)為杯狀細(xì)胞化生及MUC5AC基因表達(dá)的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和表皮生長因子受體(EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路。

本課題在“黏液高分泌”及“痰”相關(guān)理論的指導(dǎo)下，采用單純香煙煙熏建立COPD大鼠模型，以健脾益肺化痰系列方藥進(jìn)行干預(yù)治療，觀察發(fā)現(xiàn)健脾益肺化痰系列方可顯著改善COPD大鼠肺功能、血?dú)饧胺谓M織病理狀況［5］，本研究擬從氣道黏液高分泌角度，進(jìn)一步探討健脾益肺化痰系列方防治COPD的作用機(jī)制及針對(duì)“痰”進(jìn)一步辨證論治的差異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，鼠齡10～12周［購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2012-0001]，于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥實(shí)驗(yàn)用中藥材全部購自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定。生藥劑量比例按原著換算，依照人單位體質(zhì)量生藥量求得大鼠單位體質(zhì)量生藥量，擴(kuò)大10倍。各組藥物分別以純凈水煎煮30分鐘，提取2次。再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。羧甲司坦組予羧甲司坦(北京曙光藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H11021036，規(guī)格：250 mg×12片×2板/盒)500 mg/kg灌胃，劑量參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.1 健脾益肺化痰方 由四君子湯、玉屏風(fēng)散、二陳湯加桔?；梅浇M成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g，半夏10 g，陳皮10 g，桔梗10 g。

1.2.2 健脾益肺方 四君子湯合玉屏風(fēng)散組成。藥物組成：黨參15 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，炙甘草5 g，黃芪15 g，防風(fēng)6 g。

1.2.3 化痰方 即二陳湯加桔?；梅剑幬锝M成：半夏10 g，陳皮10 g，茯苓15 g，炙甘草5 g，桔梗10 g。

1.3 儀器與試劑大前門牌香煙(烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳含量14 mg)；自制動(dòng)物熏煙箱(60 cm×50 cm×40 cm)；自動(dòng)切片機(jī)、自動(dòng)包埋機(jī)；溫控儀鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；高精度可調(diào)節(jié)移液器，槍頭(白槍頭、黃槍頭、藍(lán)槍頭)；吸水紙(自備)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))；TECAN全波長酶標(biāo)儀(Thermo生產(chǎn)，Multiskan MK3)；離心機(jī)(Tomy Seiko生產(chǎn))；試管及離心管，容量瓶，蒸餾水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、健脾益肺化痰方組、健脾益肺方組、化痰方組、羧甲司坦組，共6組，每組10只。模型組于吸煙造模12周后每天給予等體積純凈水灌胃，各給藥組于吸煙第13周起于每日上午吸煙前半小時(shí)給予相應(yīng)藥物灌胃；正常組每天給予等體積純凈水灌胃。

1.4.2 COPD大鼠模型建立 參考文獻(xiàn)［7］方法，采用單純香煙煙熏法復(fù)制COPD大鼠模型。模型組及各給藥組大鼠放入自制被動(dòng)吸煙玻璃熏箱，箱頂留有通氣孔，燃燒大前門牌香煙，由三通管導(dǎo)入煙霧。1次熏煙燃燒大前門香煙12支，每支香煙約產(chǎn)生煙霧1 L，煙霧濃度約5%，持續(xù)0.5小時(shí)，每日吸煙2次，上下午各1次，每周5天，連續(xù)16周。1.4.3 實(shí)驗(yàn)取材 實(shí)驗(yàn)大鼠在末次給藥后，禁食12小時(shí)，4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉。隨機(jī)挑選等量的各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物，行正中切口，氣管插管，進(jìn)行生理鹽水支氣管肺泡灌洗3次，5 mL/次。待注入生理鹽水后，輕輕按摩肺組織30秒，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，記錄回收的灌洗液量(保證回收率＞80%)。將回收的BALF離心(3 000 r/min，4℃) 10分鐘，用于ELISA檢測(cè)。

1.4.4 酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA) 檢測(cè)大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量。

1.4.4.1 試劑盒組成 酶標(biāo)板：12條×8孔；標(biāo)準(zhǔn)品：2瓶(凍干品)；生物素標(biāo)記抗體：1×120 μL/瓶；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素：1×120 μL/瓶；生物素標(biāo)記抗體稀釋液：1×15 mL/瓶；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液：1×15 mL/瓶；樣本稀釋液：1× 50 mL/瓶；濃洗滌液：1×20 mL/瓶；底物溶液：1× 10 mL/瓶；終止液：1×10 mL/瓶；板貼：4張；密封袋：1個(gè)。

1.4.4.2 操作步驟 1)將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30分鐘，按各自試劑配制方法配制試劑以備用；2)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃溫育2小時(shí)；3)棄去液體，甩干，不用洗滌；4)每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時(shí)；5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；6)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，37℃溫育1小時(shí)；7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干；8)依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15～30分鐘；9)依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；10)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測(cè)量各孔的光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均顯著升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。健脾益肺化痰組、健脾益肺組、化痰組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B、IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量均降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3組中藥給藥組之間比較，健脾益肺化痰組(標(biāo)本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子IL-1β、TGF-α的含量下降較明顯，化痰組(治標(biāo)組)次之，健脾益肺組(治本組)COPD模型大鼠IL-1β、TGF-α含量下降最低。健脾益肺化痰組(標(biāo)本兼治組)COPD模型大鼠炎癥因子COX2、PGE2的含量下降較明顯，健脾益肺組(治本組)次之，化痰組(治標(biāo)組)COPD模型大鼠COX2、PGE2含量下降最低，見表1—2。

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

表1 各組大鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、MUC5B的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) MUC5AC MUC5B正常組 10 142.2±23.8 87.8±49.5模型組 10 782.1±93.2*1972.9±551.2*健脾益肺化痰組 10 402.5±55.6#△760.4±111.9#△健脾益肺組 10 495.1±83.1#1905.4±453.0#化痰組 10 629.8±48.6#☆1919.7±286.8#☆羧甲司坦組 10 556.5±86.9 1445.9±255.4

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、COX2、TGF-α、PGE2的含量(±s) pg/mL

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；☆表示與健脾益肺組比較，P＜0.05；△表示與化痰組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) IL-1β COX2TGF-α PGE2正常組 10 65.53±7.36 82.79±13.50 260.15±51.05 5.38±3.95模型組 10 164.43±34.97*128.36±10.45*397.21±102.84*28.76±4.38*健脾益肺化痰組 10 96.30±15.26#96.69±18.04#205.56±43.48#△☆11.33±5.34#健脾益肺組 10 152.73±24.79#△115.83±25.66#356.24±68.22 12.16±2.54#化痰組 10 101.05±23.51#117.48±26.97 341.30±64.60 12.21±3.75#羧甲司坦組 10 117.55±8.99 95.09±36.00 242.70±70.07 10.04±6.58

3 討論

杯狀細(xì)胞化生和黏液高分泌過度分泌是COPD氣道慢性炎癥的重要病理改變，過度分泌的黏液潴留于氣道，加重了已經(jīng)狹窄氣道的阻塞，加速了肺功能的下降進(jìn)程，容易導(dǎo)致氣道內(nèi)感染的發(fā)生，病情惡化。COPD氣道黏液高分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是杯狀細(xì)胞化生/增生，而IL-13、IL-1β、TNF-α信號(hào)通路參與刺激誘導(dǎo)了杯狀細(xì)胞的化生/增生。此外，EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是諸多刺激因子誘導(dǎo)MUC5AC基因表達(dá)的共同通路，多種刺激物可通過NE/TNF-α/TGF-α/EGFR等信號(hào)途徑，上調(diào)MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和MUC5AC生成［8］。IL-1β激活COX2/PGE2；經(jīng)MAPK激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasel1/2，ERK1/2)和p38-MAPK途徑，激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)，從而誘導(dǎo)MUC5AC基因的表達(dá)［9 ］。

COPD屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”“咳嗽”“喘證”“痰飲”范疇，在對(duì)其病證病機(jī)的認(rèn)識(shí)中，始終重視痰的作用［10-13］；在治療過程中，也積極化痰，大多以益氣健脾化痰法為原則［14］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，肺脾氣虛，津液不化，痰濁潴留，伏痰形成；外邪引動(dòng)伏痰，引發(fā)COPD。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)對(duì)本病進(jìn)行較為全面的研究［15］，認(rèn)識(shí)到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“氣道黏液高分泌”就是中醫(yī)學(xué)的“痰”。相關(guān)臨床研究［16-18］表明，健脾益肺化痰系列方治療穩(wěn)定期COPD患者，具有減輕臨床癥狀，減少急性發(fā)作頻率，改善呼吸功能等作用。藥理研究［19］表明，健脾益肺化痰系列方具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌抗病毒、抗纖維化、增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)功能等功效。臨床上通過抑制黏液高分泌或化痰，可以有效緩解COPD的發(fā)?。?0-21］。本實(shí)驗(yàn)選用健脾益肺化痰方及其拆方，從氣道黏液高分泌角度探討其作用機(jī)制，并著重對(duì)比分析“健脾益肺化痰標(biāo)本兼治”的干預(yù)作用。

綜上所述，健脾益肺化痰系列方中以標(biāo)本兼治的健脾益肺化痰方尤為突出，可以通過抑制COPD氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制氣道黏液高分泌，使氣道結(jié)構(gòu)重塑，改善氣道通氣狀況，最終改善COPD模型大鼠肺功能。這可能是健脾益肺化痰標(biāo)本兼治法改善COPD大鼠肺功能的效應(yīng)機(jī)制之一，可為臨床使用健脾益肺化痰系列方防治COPD提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Mac Nee W.Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Proc Am Thorac Soc，2005，2(4)：258-266.

［2］ Kirkham S，Sheehan JK，Knight D，et al.Heterogeneity of airways mucus：variations in the amounts and glycoforms of the major oligomeric mucins MUC5AC and MUC5B［J］.Biochem J，2002，361(3)：537-546.

［3］ Takeyama K，Jung B，Shim JJ，et al.Activation of epidermal growth factor receptors is responsible for mucin synthesis induced by cigarette smoke［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(1)：165-172.

［4］ 鐘相根，李宇航，祝小惠.慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌機(jī)制及中醫(yī)藥干預(yù)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(8)：1686-1689.

［5］ 李配，鄧秀蘭，鐘相根，等.健脾益肺化痰方對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺組織病理的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33(6)：1330-1332.

［6］ 孫麗.羧甲司坦對(duì)慢性被動(dòng)吸煙大鼠氣道細(xì)菌負(fù)荷的影響及相關(guān)機(jī)制的研究［D］.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2010.

［7］ 李配.基于標(biāo)本兼治“化痰”的健脾益肺化痰方對(duì)COPD大鼠氣道黏液高分泌的干預(yù)作用及其差異研究［D］.北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

［8］ Kim ST，Ye MK，Shin SH.Effects of Asian and dust on mucin gene expression and activation of nasal polyp epithelial cells［J］.Am J Rhinol Allergy，2011，25(5)：303-306.

［9］ Cosio MG，Saetta M，Agusti A.Immunologic aspects of chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2009，360(23)：2445-2454.

［10］王振偉，楊佩蘭，沈麗，等.百部養(yǎng)肺煎膏治療COPD穩(wěn)定期患者的臨床研究［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(5)：56-59.

［11］王慧卿，李躍進(jìn).痰熱清注射液治療慢性阻塞性肺病急性加重期42例［J］.河北中醫(yī)，2008，30(8)：870.

［12］李竹英，郅扶旻，劉文波.益氣健脾化痰法對(duì)COPD穩(wěn)定期患者肺功能及免疫功能的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2014(1)：51-53.

［13］王蘭娣，潘文.沙美特羅替卡松聯(lián)合益氣養(yǎng)陰合劑治療輕癥及緩解期COPD 36例［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(5)：76-77.

［14］孫朔.健脾化痰法治療慢性阻塞性肺疾病的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(2)：143-144.

［15］鐘相根，祝小惠，鄭子安，等.論“痰”在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病及治療中的重要性［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(12)：3159-3161.

［16］吳蕾，林琳，許銀姬，等.健脾益肺Ⅱ號(hào)治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期178例臨床研究［J］.中醫(yī)雜志，2011，52(17)：1465-1468.

［17］Li SY，Li JS，Wang MH，et al.Effects of comprehensive therapy based on traditional Chinese medicine patterns in stable chronic obstructive pulmonary disease：a four-center，open label，randomized，controlled study［J］.BMC Complement Alternat Med，2012，12(1)：1-11.

［18］楊珺超，王真，樓雅芳，等.益氣健脾顆粒劑聯(lián)合西藥治療慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期肺脾氣虛型60例臨床觀察［J］.中醫(yī)雜志，2013，54(22)：1933-1936.

［19］王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1997：1144-1147.

［20］楊峰，敖素華.清熱化痰法對(duì)氣道黏液高分泌大鼠氣道炎癥影響機(jī)制［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16(5)：21-24.

［21］王勝，熊玲玲，任薇，等.益氣健脾方對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，35(8)：993-999.

Airway Mucus Hypersecretion Mechanism in Rat with COPD Model and Intervention Process of Tonifying the Spleen and Nourishing the Lung as well as Eliminating Phlegm

LIU Juan,ZHONG Xianggen,DENG Xiulan△,LI Pei,QI Mingyue,ZHAO Namei College of Basic Medical Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

A

1004-6852(2016)11-0011-04

2016-01-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)81173314，81473666)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科基本科研項(xiàng)目(編號(hào)2013-ZDXKKF-03)。

劉娟(1987—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治。

△通訊作者：鄧秀蘭(1963—)，女，碩士學(xué)位，副教授。研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的診治。