趙　雪，宋文剛，蘭　英

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林　132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林　132013；3.中國科學(xué)院微生物研究所，北京　100101)

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脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及基因的克隆表達(dá)

趙雪1，宋文剛2，蘭英3

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013；3.中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101)

摘要：目的 篩選出脂肪酶活性較高菌株，通過脂肪酶基因克隆技術(shù)獲得高表達(dá)的脂肪酶，根據(jù)酶活曲線確定該酶的最適溫度和最適pH.方法 采用透明圈法，以三丁酸甘油酯為底物篩選脂肪酶活性較高菌株；通過PCR 擴(kuò)增獲得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列，構(gòu)建pET-28 a表達(dá)載體，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)；通過Ni柱將脂肪酶純化，并根據(jù)酶活曲線確定該酶的最適溫度和最適pH.結(jié)果 篩選到一株脂肪酶活性較高的菌株，16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果初步鑒定為Pseudomonas peli.PCR擴(kuò)增得到的基因片段長度為801 bp，其序列與Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性達(dá)到100%，PP基因在大腸桿菌中異源表達(dá)蛋白的分子量約29 KD，該蛋白在55 ℃、pH 7.0時(shí)活性最高.結(jié)論 通過基因克隆表達(dá)后得到的脂肪酶Ni柱純化后純度達(dá)95%以上，且耐高溫，為脂肪酶工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：脂肪酶；篩選；基因克?。患兓?/p>

【引用格式】趙雪，宋文剛，蘭英.脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及基因的克隆表達(dá)[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，17(2)：186-190.

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)為三酰甘油水解酶，是一類催化、合成和分解長鏈脂肪酸酯的酶類.脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，由細(xì)菌和真菌產(chǎn)生的脂肪酶具有催化活性多樣性、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因此成為商品化脂肪酶的主要來源.此外，脂肪酶在一些重要光學(xué)活性化合物的拆分與合成時(shí)具有極高的立體選擇專一性[1-2]，因而是一種重要的工業(yè)用酶.脂肪酶主要應(yīng)用于脂肪加工、皮革、化妝品、紡織品、乳制品、洗滌劑及造紙工業(yè)等[3-4],此外，脂肪酶還用于生物多聚體和生物柴油等化學(xué)品的合成.傳統(tǒng)方法一般采用誘變野生菌的方法進(jìn)行篩選，粗酶的提純耗時(shí)較長，人員投入及工作量較大，成本高，所以用基因工程方法生產(chǎn)脂肪酶已成為首選方法[5].目前，基因工程方法生產(chǎn)的微生物來源的脂肪酶主要集中于根霉屬、青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、地酶屬、假絲酵母屬、伯克霍爾德菌屬、假單胞屬等有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的菌株.大多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度為30～50 ℃[6]，只有個(gè)別細(xì)菌脂肪酶最適作用溫度為65 ℃，如洋蔥伯克霍爾德菌ZYB002[7]，而在應(yīng)用廣泛的假單胞菌屬脂肪酶中尚未發(fā)現(xiàn)耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌.

本文采用透明圈法，以三丁酸甘油酯為底物篩選到一株脂肪酶活性較高菌株，16S rRNA 基因序列比對(duì)結(jié)果初步鑒定為Pseudomonaspeli，通過PCR 擴(kuò)增獲得其脂肪酶基因Pseudomonaspeli(PP)序列，構(gòu)建pET-28a表達(dá)載體，并在大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)；通過Ni柱將脂肪酶純化，并根據(jù)酶活曲線確定該酶的最適溫度和最適pH，通過與其他已報(bào)道脂肪酶相比較具有耐高溫特點(diǎn)，為下一步脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌株與質(zhì)粒

候選菌株由本實(shí)驗(yàn)室從西寧湟水河淤泥中分離培養(yǎng)得到.菌株E.coliDH5ɑ和E.coliBL21(DE3)(北京索萊寶科技有限公司)；質(zhì)粒pET-28ɑ和pMD-19T(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司).

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

三丁酸甘油酯(北京寶如億生物技術(shù)有限公司)；2X Taq PCR MasterMix(北京天根生物有限公司)；BamHⅠ、HindⅢ 限制性內(nèi)切酶、SolutionⅠ DNA連接酶(北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司)；DNA凝膠回收試劑盒(北京中科助研科技有限公司)；質(zhì)粒小提試劑盒(北京華力德科技有限公司)；DNA marker (北京博邁德生物科技有限公司)；卡那霉素(北京索萊寶科技有限公司)；IPTG 誘導(dǎo)劑(北京盛世前塵生物科技有限公司)；TEMED(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司).

1.3培養(yǎng)基及溶液配制

LB液體培養(yǎng)基配制：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化鈉(NaCl)10 g，加蒸餾水至1 L，調(diào)pH至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min.

LB固體斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化鈉(NaCl)10 g、瓊脂(Agar)、加蒸餾水至1 L，調(diào)pH至7.0，121 ℃高壓滅菌30 min.

三丁酸甘油酯培養(yǎng)基：胰蛋白胨(Tryptone)10 g、酵母提取物(Yeast Extract)5 g、氯化鈉(NaCl)10 g，瓊脂(Agar)、98%三丁酸甘油酯11 mL，調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，超聲30 min，倒板備用.

lysis buffer：150 mmol NaCl+25 mmol Tris-HCl，pH 8.0；Washing buffer：lysis+20 mmol咪唑；Eluting buffer：lysis+250 mmol咪唑.

1.4實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(TELSTAR BV-30/70)；離心機(jī)(Beckman Coulter Microfuge 22R)；純水儀(ELGA LabWater PURELAB Flex)；PCR儀(SensoQuest LabCycler DP-88)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(ZDP-2270)；水浴鍋(DK-8D).

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

挑選60株候選細(xì)菌，分別接種于固體LB平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落分別接種于50 mL液體培養(yǎng)基中30 ℃擴(kuò)大培養(yǎng).用打孔器將事先配制好的三丁酸甘油酯平板培養(yǎng)基打孔，每孔加入同樣濃度的菌液30 μL，30 ℃培養(yǎng)38 h后測量每孔透明圈直徑.

2.2DNA提取及16S初步鑒定

DNA提取采用Takara DNA提取試劑盒，具體操作詳見試劑盒操作說明書.16S初步鑒定：用提取基因組DNA擴(kuò)增其16S rRNA片段，擴(kuò)增后片段在http：//www.ezbiocloud.net/網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì).

2.3引物設(shè)計(jì)與合成

查找PP脂肪酶基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5根據(jù)PP基因序列來設(shè)計(jì)引物(包括BamHⅠ和Hind Ⅲ 限制性酶切位點(diǎn))，上游引物：GGATCCTCAGGGTTCGAGCGGC；下劃線表示BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物：AAGCTTCATGTCCA GATTCTTCAGCCTT；下劃線表示HindⅢ 酶切位點(diǎn)(由上海生工生物有限公司合成).

2.4脂肪酶基因克隆

以基因組DNA為模板，利用上述合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃加熱變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，延伸10 min后終止反應(yīng).擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用凝膠回收試劑盒將電泳片段回收.根據(jù)PCR產(chǎn)物的量計(jì)算連接用載體的量，16 ℃連接過夜.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5ɑ，37 ℃孵箱培養(yǎng)12～16 h.

挑取藍(lán)白斑篩選后的陽性克隆，進(jìn)行菌落PCR.然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，挑取PCR鑒定為陽性的克隆接種于液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng).

2.5構(gòu)建重組質(zhì)粒

過夜培養(yǎng)菌株離心后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒.將帶有目的基因的質(zhì)粒與pET-28ɑ載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切.雙酶切體系：BamHⅠ 1 μL；HindⅢ 1 μL；10×buffer K 5 μL；質(zhì)粒15 μL；加去離子水至50 μL，37 ℃反應(yīng)3 h.將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳產(chǎn)物經(jīng)過DNA回收試劑盒回收純化；純化后目的基因與pET-28ɑ質(zhì)粒進(jìn)行連接.連接體系：SolutionⅠ 7 μL；DNA 4 μL；pET-28ɑ 3 μL，16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5ɑ，將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含卡那霉素的固體LB平板上，37 ℃孵箱倒置培養(yǎng)12～16 h.

2.6構(gòu)建重組菌

取2.5中過夜培養(yǎng)的菌液2 mL，12 000 r/min 離心3 min，棄去上清，菌體用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證后將重組質(zhì)粒送至北京諾賽基因有限公司測序，確定插入位點(diǎn)的正確性.將測序驗(yàn)證的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)菌株rePP.

2.7脂肪酶rePP表達(dá)、純化

挑取重組菌rePP/E.coliBL21(DE3)，加入LB培養(yǎng)基(含100 mg/mL卡那霉素)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.6；加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.5 mmol)，26 ℃誘導(dǎo)過夜；8 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入 lysis buffer緩沖液(菌體加6 mL/g緩沖液)，超聲波破碎10 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，即為PP粗酶液.將粗酶液經(jīng)過12 000 r/min離心10 min，取上清加入到鎳柱中進(jìn)行純化.

土地執(zhí)法困境成因分析（吳桐） .....................................................................................................................3-45

2.8脂肪酶活性測定及最適條件選擇

2.8.1脂肪酶活性測定

脂肪酶活性測定采用對(duì)硝基苯酚法.將對(duì)硝基苯酚(p-NP)稀釋成適當(dāng)濃度梯度，于410 nm處測定吸光度，繪制吸光度-濃度曲線.脂肪酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為1個(gè)脂肪酶活力單位(U).

2.8.2最適溫度檢測

利用對(duì)硝基苯酚法，選取25～70 ℃范圍，每間隔5 ℃，分別測定不同溫度的脂肪酶的活性.

2.8.3最適pH檢測

選取pH 6.0～9.5范圍內(nèi)，每間隔pH 0.5在最適溫度下分別測定脂肪酶活性，計(jì)算脂肪酶rePP的最適pH.

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1脂肪酶產(chǎn)生菌篩選及16S rRNA結(jié)果

依據(jù)2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選方法，利用三丁酸甘油酯培養(yǎng)基從60株菌中篩選活性較好的菌株，結(jié)果如圖1，其中透明圈最大的菌株為產(chǎn)脂肪酶活性最高菌株.16S rRNA 片段擴(kuò)增后在http：//www.ezbiocloud.net/比對(duì)，序列與PseudomonaspeliR-20805，Genebank登錄號(hào)為AM114534，相似度為99.12%.

3.2脂肪酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增后經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到801 bp左右的脂肪酶基因，圖2為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖.

3.3T載體陽性克隆子篩選

挑取4個(gè)克隆子，進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆子，圖3為菌落PCR鑒定電泳圖，挑取的4個(gè)克隆子中兩個(gè)為陽性克隆子，另外兩個(gè)為陰性.

3.4重組菌陽性克隆子篩選及鑒定

挑取重組菌單個(gè)克隆，進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，圖4為菌落PCR鑒定電泳圖，挑取的單個(gè)克隆全部為陽性克隆.測序公司測序結(jié)果也進(jìn)一步證明目的片段插入位點(diǎn)正確，可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株.

3.5重組脂肪酶表達(dá)純化

純化的重組脂肪酶通過SDS-PAGE電泳得到一條電泳帶，其分子量大小約為29 KD左右(圖5)，與預(yù)測的分子量大小一致，重組的脂肪酶已經(jīng)過Ni柱純化.

3.6脂肪酶活性測定

通過對(duì)硝基苯酚繪制吸光度-濃度曲線y=0.031 34x-0.005 69，R2= 0.994 61，37 ℃，pH 8.0測定表達(dá)后脂肪酶活性，其活性單位約為23 750 U/g.

3.7最適溫度與最適pH

在不同溫度和不同pH條件下測定脂肪酶反應(yīng)的吸光度，根據(jù)吸光度測定計(jì)算脂肪酶活性，發(fā)現(xiàn)其在55 ℃、pH 7.0時(shí)活性最高.圖6為脂肪酶最適溫度結(jié)果，圖7為脂肪酶最適pH結(jié)果.

4討論

為減少化學(xué)試劑對(duì)環(huán)境的影響，脂肪酶漸漸成為必不可少的工業(yè)用酶.酶的開發(fā)和應(yīng)用具有一定的市場前景，從2004 年起全球工業(yè)用酶產(chǎn)值高達(dá) 20 億美元，并且年平均增長率為 4%～5%[8].基因工程技術(shù)和新生產(chǎn)技術(shù)的聯(lián)合使用改善了工業(yè)用酶的性能，降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量.

Apriny等[9]整理了微生物脂肪酶的核苷酸、蛋白質(zhì)及晶體結(jié)構(gòu)等有關(guān)信息，提出了脂肪酶分類方法，這種方法將脂肪酶分為8個(gè)家族，即True lipase(Family Ⅰ)，The GDSL family，F(xiàn)amily Ⅲ，The hormoe-sensitive lipase(HSL)family，F(xiàn)amily V-VⅢ，其中True lipase又包括7個(gè)亞族FamilyⅠ.1～Family Ⅰ.7，該家族成員較多，序列差異較大，主要包括假單胞菌屬脂肪酶，而文中所研究的脂肪酶就是這個(gè)家族的一員.多數(shù)細(xì)菌脂肪酶的最適作用溫度和pH范圍為35～45 ℃和8.0～9.0.Zheng等[7]發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克霍爾德菌ZYB002全細(xì)胞脂肪酶最適溫度達(dá)65 ℃，而其他種屬的細(xì)菌脂肪酶尚未發(fā)現(xiàn)最適溫度為50 ℃以上的脂肪酶，本文中假單胞菌脂肪酶最適溫度達(dá)到了55 ℃，粗酶在最適溫度下活性為421 U/mL，經(jīng)計(jì)算菌體酶活約為25.26 U/mL，而洋蔥伯克霍爾德菌ZYB002全細(xì)胞脂肪酶雖然耐高溫，但在最適溫度下活性僅為22.8 U/mL，并且洋蔥伯克霍爾德菌為條件致病菌，不宜應(yīng)用于醫(yī)藥或食品工業(yè).本文中所研究的脂肪酶在55 ℃高溫下體現(xiàn)較高活性，且在70 ℃下仍保留70%活性，可以成為高溫下應(yīng)用于醫(yī)藥或食品工業(yè)的首選酶，同時(shí)為其他高溫下水解或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的研究奠定了基礎(chǔ).另外，探索新型的固定化技術(shù)，提高酶的利用率，也成為解決工業(yè)用酶的重點(diǎn).因此，為了滿足工業(yè)用酶市場需求，我們必須加快對(duì)微生物脂肪酶研究與開發(fā)，同時(shí)積極拓展微生物脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域.

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【責(zé)任編輯：陳麗華】

Isolation of Lipase-producing Strain and the Cloning Expression ofPseudomonasPeli

Zhao Xue1，Song Wengang2，Lan Ying3

(1.PharmacyCollegeofBeihuaUniversity，Jilin132013，China；2.SchoolofBasicMedicine，BeihuaUniversity，Jilin132013，China；3.InstituteofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China)

Abstract：ObjectiveTo isolate lipase-producing strains from mud，to clone and characterize the lipase gene，and to determine the optimum temperature and pH.MethodHigh activity lipase-producing strains were screened using tributyrin as substrate by transparent ring method.Lipase gene sequence of Pseudomonas peli(PP)was obtained by PCR amplification using the genomic DNA as template.The expression plasmid pET-28a-PP(rePP)was constructed and expressed in Escherichia coli BL21(DE3).Lipase enzyme was purified by Ni column，and the optimum temperature and pH were determined according to the activity curve.ResultsA high lipase activity strain was isolated，and was preliminarily identified as Pseudomonas peli.The fragment obtained from PCR amplification was 801 bp，which shared 100% sequence identity with that from PP.The protein of PP was expressed in E.coli BL21(DE3)with the molecular of 29 KD.The purified recombinant enzyme showed high lipolytic activity at temperature 55 ℃ and pH 7.0.ConclusionThe PP gene was obtained，and the over expression protein with high lipolytic activity was obtained in this study，which maybe widely used in industry.

Key words：lipase；isolation；gene cloning；purification

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：趙雪(1990-)，女，碩士研究生，主要從事藥物化學(xué)研究，E-mail：365786049@qq.com；通信作者：宋文剛(1968-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物化學(xué)研究，E-mail：bhdx@vip.sina.com；蘭英(1968-)，女，博士，副研究員，主要從事微生物學(xué)研究，E-mail：lanying@im.ac.cn.

基金項(xiàng)目：中國科學(xué)院院地合作項(xiàng)目；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2012AA02A702).

收稿日期：2015-11-03

文章編號(hào)：1009-4822(2016)02-0186-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.009