王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015

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基于熒光標(biāo)記SSR的CID法快速鑒定福建茶樹品種

王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳
福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015

摘要：茶樹品種真實性鑒定是茶樹種質(zhì)資源研究的重要組成部分，是茶樹品種知識產(chǎn)權(quán)保護的前提。在茶樹基因組上按照均勻分布的原則選擇45個SSR標(biāo)記合成熒光標(biāo)記引物，利用這些標(biāo)記引物對54個福建無性系茶樹品種進行PCR擴增，標(biāo)記基因型分型后進一步篩選出9個SSR標(biāo)記核心引物。這批核心引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）均大于0.5，等位位點數(shù)在3～5之間，基因型數(shù)在5～10之間，屬于高度多態(tài)性引物且方便進行基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計，適宜用來進行無性系茶樹品種的真實性鑒定。利用其中的6個標(biāo)記核心引物建立了54個福建無性系茶樹品種的品種鑒別圖（Cultivar identification diagram，CID），該CID能直觀地提供對其中任意品種進行鑒定所需要的標(biāo)記引物以及相應(yīng)的標(biāo)記基因型，且能夠方便地進行擴容以用來對更多的無性系茶樹品種進行真實性鑒定。利用該方法對無性系茶樹品種進行真實性鑒定，操作方便、快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高、實用性強。本實驗所獲得的茶樹品種鑒定圖（CID）對茶樹品種知識產(chǎn)權(quán)保護，以及促進茶樹品種選育工作健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：茶樹；SSR；品種鑒別圖（CID）；品種鑒定

茶樹是我國山地丘陵地區(qū)重要的經(jīng)濟作物，茶產(chǎn)業(yè)也是茶區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。隨著現(xiàn)代茶產(chǎn)業(yè)的加速發(fā)展與轉(zhuǎn)型升級，人們在名優(yōu)茶開發(fā)與制作過程中愈發(fā)重視茶樹良種所起到的提質(zhì)增效的基礎(chǔ)性作用。茶樹是多年生異花授粉自交不親和木本作物，具有常規(guī)育種周期長（育成一個茶樹良種需要20多年），但容易利用枝條扦插進行無性繁殖的特點[1]。該特點意味著一個茶樹良種如獲生產(chǎn)認(rèn)可，即可迅速無性繁殖推廣，茶樹品種侵權(quán)現(xiàn)象極易發(fā)生。為保護茶樹良種知識產(chǎn)權(quán)和促進茶樹良種選育工作健康可持續(xù)發(fā)展，需要建立一套快速、準(zhǔn)確、科學(xué)、實用的茶樹良種真實性鑒定方法。

隨著現(xiàn)代茶樹育種工作的蓬勃發(fā)展，越來越多的茶樹良種來源于少數(shù)育種骨干親本，且茶樹表型性狀易受環(huán)境因子等影響，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)品種鑒定方法已難以有效鑒定眾多的茶樹良種。DNA指紋圖譜具有準(zhǔn)確鑒定大量茶樹品種的能力[2-3]，但其本身僅是數(shù)字化的順序組合，提供的鑒定過程信息相對較少。品種鑒定圖（Cultivar identification diagram,CID）可將品種鑒定過程充分的體現(xiàn)出來并提供所需的標(biāo)記引物以及品種鑒定相應(yīng)的標(biāo)記基因型[4]。該方法的開發(fā)很好地解決了DNA標(biāo)記有效應(yīng)用于品種鑒定的問題，使DNA標(biāo)記在品種鑒定中的可操作性和實用性得到充分發(fā)揮，目前燈籠果[5]、蘋果[6]、葡萄[7]等果樹品種鑒定已有運用該技術(shù)的報道。

茶樹分子標(biāo)記技術(shù)研究始于上世紀(jì)90年代，迄今為止多種DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于茶樹種質(zhì)資源領(lǐng)域研究[8-12]。在眾多DNA分子標(biāo)記中，SSR由于具有共顯性、位點豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高等諸多優(yōu)點而備受青睞[13-15]。本實驗以54個福建無性系茶樹品種為參試材料，利用熒光標(biāo)記的SSR分子標(biāo)記方法建立茶樹品種鑒定圖（CID），并對其可靠性與可操作性加以驗證，以期為茶樹良種的快速鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護提供參考。

1 材料和方法

1.1 參試材料

參試無性系茶樹品種來自于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃（表1），各品種采集春季新梢一芽二葉，每個品種獨立選取2個單株，保鮮袋封存后置–70℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

采用CTAB法[16]分別提取不同茶樹品種2個重復(fù)的基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA大小和完整性，用756-MC型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的OD260、OD280值，分析計算基因組DNA純度和濃度，用1×TE緩沖液稀釋基因組DNA至終濃度為30 ng·μL-1，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成

參考文獻[17]，在茶樹基因組上按照均勻分布的原則選取45個SSR標(biāo)記（茶樹共15個連鎖群，平均每個連鎖群選取3個標(biāo)記），進一步合成熒光標(biāo)記SSR引物。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測與數(shù)據(jù)讀取

反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3 μL，MgCl22 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，Taq酶1 μL(0.5 U)，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性1 min，不同溫度條件退火1min，72℃延伸1 min，重復(fù)35個熱循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。在96孔板內(nèi)加入1 μL DNA擴增樣品與10 μL ROX500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，震蕩混勻，使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析儀檢測PCR擴增產(chǎn)物。結(jié)合不同標(biāo)記引物的基序堿基個數(shù)，對小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位讀取數(shù)據(jù)。

表1　參試無性系茶樹品種信息Table 1 The information of tested clonal tea cultivars

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測與數(shù)據(jù)讀取

反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3 μL，MgCl22 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，Taq酶1 μL （0.5 U），模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性1 min，不同溫度條件退火1 min，72℃延伸1 min，重復(fù)35個熱循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。在96孔板內(nèi)加入1 μL DNA擴增樣品與10 μL ROX500分子量標(biāo)準(zhǔn)工作液，震蕩混勻，使用Applied Biosystems 3730xl DNA分析儀檢測PCR擴增產(chǎn)物。結(jié)合不同標(biāo)記引物的基序堿基個數(shù)，對小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位讀取數(shù)據(jù)。

1.2.5 引物篩選

利用PIC-CALC V0.6軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC），其中，Pi為第i個位點的基因型頻率[18]。按照如下標(biāo)準(zhǔn)進一步篩選茶樹品種真實性鑒定的SSR核心引物：①PIC≥0.5；②3≤等位位點數(shù)≤5；③5≤基因型數(shù)≤10。

1.2.6 茶樹CID的建立

按如下方法建立茶樹CID：如果某個品種在某個標(biāo)記位點上具有與其他品種均不同的基因型出現(xiàn)，那么這個品種即被鑒定；如果某組品種在某個標(biāo)記位點上均具有相同的基因型出現(xiàn)，那么這組品種即被分到同一組；利用不同的標(biāo)記引物繼續(xù)對同一組品種進行鑒定，直至所有品種完全鑒定。

1.2.7 茶樹CID的驗證

隨機選擇任意參試茶樹品種驗證茶樹CID的可靠性與可操作性。如果隨機選擇的品種能被快速準(zhǔn)確地鑒定，則判定建立的茶樹CID具有實際應(yīng)用價值。

2 結(jié)果和分析

2.1 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性檢測

對不同無性系品種兩次重復(fù)分別檢測及讀取數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)在小數(shù)位以及部分個位上存在一定的差異，但結(jié)合考慮標(biāo)記引物的基序堿基個數(shù)，并對小數(shù)位采取四舍五入，保留整數(shù)位進行處理后，重復(fù)之間數(shù)據(jù)無差異，說明熒光標(biāo)記SSR檢測方法重復(fù)之間數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高，如表2所示。

2.2 SSR標(biāo)記核心引物篩選

利用45個熒光標(biāo)記SSR引物對54個參試無性系茶樹品種進行PCR擴增，進一步篩選出9個SSR標(biāo)記核心引物，如表3所示。

表2　紅芽佛手茶樹品種的檢測結(jié)果Table 2 the detection results of Hong-Ya-Fo-Shou

2.3 茶樹CID的建立

首先標(biāo)記核心引物TM351可將參試茶樹品種分成8種基因型，按照不同大小等位位點的存在以“+”表示。其中第1種基因型為“+238+262”，僅包括13號品種，這個品種可被立即鑒定。其余7種基因型均包括2個以上的茶樹品種，按基因型不同分成相應(yīng)的7個組。第1組基因型為“+238”，包括12、25；第2組基因型為“+250”，包括38、49、41；第3組基因型為“+238+250”，包括42、18、26；第4組基因型為“+244+256”，包括31、17、39、23；第5組基因型為“+238+244”，包括19、15、10、11、8、6、21；第6組基因型為“+244”，包括37、48、45、51、47、44、16、35、1、7、5、9、43、22、14、28、36、40、20；第7組基因型為“+244+250”，包括29、3、30、54、24、52、53、34、46、2、50、27、32、4、33。

進一步利用其他篩選出來的標(biāo)記核心引物鑒定以上7個組的所有品種。其中第1組12、25利用TM581可分成“+222+228”和“+222”兩種基因型，這兩個品種隨即被鑒定。第2組38、49、41利用TM581可分成“+222+234”、“+222+228”、“+240”3種基因型，這3個品種亦可被隨即鑒定。另外5組品種利用該方法以及相應(yīng)的標(biāo)記引物可依次鑒定，直至所有品種被鑒定出來。

由于同一標(biāo)記引物可以對不同組品種同時進行鑒定，因此該方法可以達到及時、充分利用引物的效果，這樣不易出現(xiàn)過多使用引物的現(xiàn)象，提高了引物利用效率。然后根據(jù)所有引物及相應(yīng)的標(biāo)記基因型信息繪制參試茶樹CID，如圖1所示。該圖可以提供鑒定任意參試無性系茶樹品種所需要的引物以及依據(jù)的標(biāo)記基因型，從而可對茶樹品種進行快速鑒定。利用茶樹CID對單個品種進行鑒定時，實際上是利用1組標(biāo)記依次進行鑒定，而不僅僅是利用單一標(biāo)記的差異來鑒定，因此，該方法鑒定結(jié)果相對單一標(biāo)記而言可靠性更高。

表3　篩選出的用于建立茶樹品種鑒定圖的核心引物Table 3 Core primer pairs chosen for creating the cultivar identification diagram

2.4 茶樹CID的驗證

茶樹CID的可靠性和可操作性需要進行驗證，該驗證也是對如何使用茶樹CID進行品種鑒定的說明。對茶樹CID中任意品種進行鑒定，可以很容易地找到所需要的標(biāo)記引物以及需要參考的標(biāo)記基因型。

隨機選擇3個茶樹品種進行驗證，如品種1、2、3，從茶樹CID上看這3個品種利用標(biāo)記核心引物TM351、TM581和TM442可以完全鑒定開來。首先，利用TM351對1、2、3進行PCR擴增，其中1出現(xiàn)“+244”基因型（圖2-A），故品種1被鑒定出屬于茶樹CID 第6組，2、3出現(xiàn)“+244+250”（圖2-B、圖2-C）基因型，故品種2、3被鑒定出屬于茶樹CID第7組，由于茶樹CID第6組、第7組分別包括19、15個品種，所以還需進一步鑒定。其次，利用TM581對1品種進行擴增，出現(xiàn)“+228+234”基因型（圖3-A），故1被鑒定出屬于第6組的第2亞組，由于該亞組包括3個品種，所以還需進一步鑒定。利用TM581對2、3品種進行擴增，這兩個品種均出現(xiàn)“+228”基因型（圖3-B、圖3-C），故2、3被鑒定出屬于第7組的第2亞組，由于該亞組包括4個品種，所以還需進一步鑒定。最后，利用TM442對1進行擴增，出現(xiàn)“+268+292”基因型（圖4-A），由于該基因型僅包括唯一的品種，故品種1的鑒定結(jié)果與茶樹CID一致，即品種1被鑒定。利用TM442 對2、3進行擴增，其中2出現(xiàn)“+286”基因型（圖4-B），3出現(xiàn)“+268+280”基因型（圖4-C），由于這2種基因型均僅包括唯一的品種，故品種2、3的鑒定結(jié)果與茶樹CID一致，即品種2、3被鑒定。上述鑒定過程完全符合圖1，這也驗證了茶樹CID技術(shù)用于茶樹品種真實性鑒定具有良好的穩(wěn)定性和可操作性。

圖1　參試54個無性系茶樹品種CID示意圖Fig.1 CID schematic diagram of 54 tested clonal tea cultivars

圖2　標(biāo)記引物TM351對3個無性系茶樹品種鑒定結(jié)果的驗證Fig.2 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM351

圖3　標(biāo)記引物TM581對3個無性系茶樹品種鑒定結(jié)果的驗證Fig.3 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM581

圖4　標(biāo)記引物TM442對3個無性系茶樹品種鑒定結(jié)果的驗證Fig.4 Verification of the identification results of 3 clonal tea cultivars by TM442

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記核心引物的篩選

利用SSR分子標(biāo)記進行品種真實性鑒定時核心引物的篩選非常重要，本實驗從如下方面確保篩選的SSR引物能夠高效、準(zhǔn)確地應(yīng)用于茶樹品種真實性鑒定。首先，在茶樹15個連鎖群上按照均勻分布的原則選取45個SSR標(biāo)記，平均每個連鎖群3個SSR標(biāo)記，這樣可以避免篩選的SSR標(biāo)記核心引物過分集中于少數(shù)連鎖群，從而確保SSR標(biāo)記核心引物具有一定的代表性。其次，篩選的多態(tài)性SSR核心引物的PIC值均大于0.5，說明這些核心引物均為高度多態(tài)性引物[19]，這樣能夠利用盡量少的標(biāo)記鑒定盡量多的品種，可以降低鑒定成本和提高鑒定效率。最后，篩選的多態(tài)性SSR核心引物等位位點數(shù)在3～5之間，基因型數(shù)在5～10之間，這2個參數(shù)均處于一個比較低的水平，方便進行分子標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計，既減少了統(tǒng)計工作量，又減小了因基因型數(shù)據(jù)偏大而產(chǎn)生統(tǒng)計誤差的風(fēng)險。

3.2 熒光標(biāo)記SSR檢測方法的應(yīng)用

SSR標(biāo)記主要表現(xiàn)為核苷酸重復(fù)基序重復(fù)次數(shù)的變化，多態(tài)性片段長度的差異可以小到2 bp水平，常規(guī)PAGE膠檢測方法，不僅要耗費大量的人力和時間進行基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計，而且在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)采集和分析方面，存在相當(dāng)大的缺陷，主要體現(xiàn)為差異較小的等位變異難以準(zhǔn)確識別、不同批次反應(yīng)數(shù)據(jù)難以統(tǒng)一處理等[20]。熒光標(biāo)記電泳檢測方法通過與內(nèi)標(biāo)比較，依據(jù)待檢品種目標(biāo)峰的位置，即可直接讀出目標(biāo)DNA片段的準(zhǔn)確大小，精確度可以達到1 bp水平。該方法還允許多重?zé)晒鈽?biāo)記，可成倍地提高檢測效率[21]。此外，該檢測方法不僅同一品種不同重復(fù)之間的結(jié)果非常一致，而且對不同品種之間的等位變異檢測也具有良好的吻合性[22]。本實驗2個重復(fù)間數(shù)據(jù)無差異，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性，進一步證實了熒光標(biāo)記SSR檢測方法準(zhǔn)確性高。

3.3 茶樹CID的使用及擴容

利用茶樹CID可將茶樹品種鑒定過程充分體現(xiàn)出來。如果需鑒定的品種包含于建立的CID，可以很容易地從CID中快速選出特定的引物及其相應(yīng)的標(biāo)記基因型對待鑒定的品種進行鑒定；如果需要鑒定的品種未包含于建立的CID，亦可直接利用CID圖中的6個標(biāo)記核心引物對該品種進行單獨PCR分析，若發(fā)現(xiàn)其具有不同于CID圖中的標(biāo)記基因型出現(xiàn)，則很容易將需要鑒定的茶樹新品種添加到該CID中去，若發(fā)現(xiàn)與CID圖中的某些品種難以區(qū)分，則繼續(xù)選用新的SSR標(biāo)記引物對這些無法分開的品種進行鑒定。本實驗篩選出的未用來建立參試無性系茶樹品種CID的核心引物亦可用來對茶樹CID進行擴容。此外，對未包含于茶樹CID的茶樹新品種的鑒定是單獨進行的，無需對CID圖中的所有品種進行重復(fù)鑒定，因此完成新品種鑒定的工作量不是太大。

致謝：本實驗參試材料的采集得到了陳常頌、游小妹、鐘秋生、鄭國華等先生的支持幫助，謹(jǐn)此一并致謝！

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An Efficient Identification of Tea Cultivars in Fujian with A Strategy of Cultivar Identification Diagram(CID)Based on Fluorescent Labeled SSR Markers

WANG Rangjian,YANG Jun,KONG Xiangrui,GAO Xiangfeng

Tea Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Science/Fujian Branch,National Center for Tea Improvement,Fu′an 355015,China

Abstract:The authenticity identification of tea cultivars is an important part of the research on tea germplasm resources,and the precondition of intellectual property protection of tea cultivars,45 SSR markers were selected to synthesize fluorescent labeled SSR primer pairs based on the principle of uniform distribution in the genome of the tea plant.Using these markers,54 clonal tea cultivars in FUJIAN province were amplified by PCR and 9 SSR markers were selected as the core primer pairs after genotyping.The polymorphism information content(PIC)of the core primer pairs was more than 0.5,and the number of all alleles was varied from 3 to 5,the number of genotypes was varied from 5 to 10.These core primer pairs were suitable for identifying the authenticity of tea cultivars for 54 Fujian clonal tea cultivars due to high polymorphism and convenient to genotype.The cultivar identification diagram(CID)was then established using 6 of these core primer pairs.The CID provided primer pairs and its corresponding genotype,by which any cultivar in the CID could be identified.The capacity of the CID can be expanded so as to facilitatebook=211,ebook=104the authenticity identification of more clonal tea cultivars.The method was considered to be easy,fast,accurate,stable and practical for the authenticity identification of tea cultivars.The CID is important for the protection of intellectual property of tea cultivars,and will be helpful for the healthy and sustainable development of tea breeding.

Keywords:tea plant[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze],SSR,cultivar identification diagram(CID),cultivar identification

作者簡介：王讓劍，男，助理研究員，主要從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究，E-mail:rangjian.wang@163.com

基金項目：福建省自然科學(xué)基金(2015J01098)、福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1012-6)、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉科技創(chuàng)新團隊項目(CXTD-1-1302)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室開放基金(LTBB20140102)。

收稿日期：2015-09-09

修訂日期：2015-10-16

中圖分類號：S571.1；S326

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-210-09