陳熙，張羽*，李佼，席彥軍，張顏青.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 7000；.陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 漢中 7000；.漢中植物研究所，陜西 漢中 7000

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SCoT標記分析陜西茶樹資源的遺傳多樣性

陳熙1，張羽1*，李佼2，席彥軍2，張顏青3
1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 漢中 723000；3.漢中植物研究所，陜西 漢中 723000

摘要：選用6份有代表性的陜西茶樹資源材料，從121條SCoT引物中篩選出38條擴增條帶清晰、多態(tài)性高的引物，對陜西省50個茶樹資源進行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明，SCoT標記能夠揭示材料間較高的遺傳多樣性，每條引物可檢測到4～17個等位位點，平均為11個，38條SCoT引物共擴增出414條DNA片段，其中400條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率（PPB）為96.62%。每個SCoT位點的遺傳多態(tài)性信息含量在0.56～0.99之間，平均為0.90。供試材料的遺傳相似系數(shù)集中在0.59～0.71之間。研究表明，SCoT標記可以用來對茶樹進行遺傳基礎(chǔ)研究，基于SCoT標記的陜西省主要茶樹資源遺傳多樣性較高。

關(guān)鍵詞：茶樹；SCoT；多樣性

隨著分子生物學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，作為第4代遺傳標記的DNA分子標記技術(shù)以無可比擬的優(yōu)越性得到飛速發(fā)展。與其他標記相比，DNA分子標記技術(shù)直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受環(huán)境、生物組織、發(fā)育時期等的影響，表現(xiàn)出穩(wěn)定性、多態(tài)性高，并能真實反映生物材料在遺傳物質(zhì)上的差異，因而被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性研究。根據(jù)DNA標記的特異性可將其分為隨機引物標記（如RAPD）、半隨機引物標記（如SRAP、SCoT）和特異引物標記（如SSR、SNP）。隨機引物標記開發(fā)成本最低、操作簡便、通用性好，但大多呈顯性遺傳，重復(fù)性較差，因而對于基因組信息還不清楚的生物可以用這類DNA標記；半隨機引物標記是基于基因組DNA某些區(qū)域如外顯子、內(nèi)含子、調(diào)控序列的保守性來設(shè)計引物，比隨機引物標記特異性強，有一定的目的性；特異引物標記根據(jù)特定生物的測序結(jié)果開發(fā)，開發(fā)成本高、穩(wěn)定性好、呈共顯性。

SCoT（Start codon targeted polymorphism）標記也稱為目標起始密碼子多態(tài)性標記，其原理是依據(jù)植物翻譯起始位點ATG側(cè)翼區(qū)域的保守性設(shè)計單引物對基因組進行擴增，即第1個翻譯的起始密碼子ATG（+1、+2和+3）、G、A、C、C（+4、+7、+8和+9位），這7個核苷酸是固定的，在－3、－6和－9位，G是偏好堿基，其他位置為體現(xiàn)多樣性的填充序列，引物總長度為18 bp，這種長度的引物能夠有效保證擴增的保守性，并在很大程度上降低假陽性擴增出現(xiàn)的機率。SCoT分子標記技術(shù)作為新型分子標記技術(shù)在種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性等研究上已有報道。Bertrand最先在水稻上利用此標記[1]，迄今，SCoT分子標記技術(shù)已應(yīng)用于花生[2]、柑橘[3]、芒果[4]、甘蔗[5]、番木瓜[6]、牡丹[7]等植物的遺傳多樣性分析。目前，在茶樹遺傳多樣性研究上主要使用的分子標記技術(shù)有RAPD、ISSR、SSR、SRAP等[8-19]，尚未見SCoT分子標記技術(shù)在茶樹中應(yīng)用的研究報道。

茶樹作為異花授粉植物，在經(jīng)過長期的天然雜交后，加之人工和自然選擇，遺傳背景從理論上講應(yīng)該較復(fù)雜。陜西省茶樹種質(zhì)資源在中國屬于江北茶區(qū)，近年來種植的茶樹品種主要從福建、安徽、浙江和湖南等省引進，歷史遺留的當?shù)厝后w種依然占大部分，集中分布于漢中地區(qū)和安康地區(qū)，包括紫陽群體種、西鄉(xiāng)大河壩、南鄭碑壩、寧強廣平群體種等，但由于陜西茶樹育種工作開展緩慢，對陜西茶樹資源的遺傳背景了解較少。本研究利用SCoT分子標記對陜西省茶樹主要種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究，了解其遺傳背景，明確各材料間的親緣關(guān)系，為陜西省茶樹資源保護和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料從陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所茶葉試驗基地及不同茶區(qū)搜集。

1.2 方法

1.2.1 茶樹基因組提取

用改良CTAB法提取茶葉基因組DNA。

1.2.2 基因組DNA檢測

采用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測茶葉基因組DNA。

1.2.3 PCR擴增反應(yīng)體系及程序

PCR反應(yīng)體系為15 μL：2×Taq Master Mix 7.5 μL，10 μmol·L-1SCOT單引物2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序為：94.0℃預(yù)變性3 min，94.0℃變性1 s，50.0℃退火1 min，72.0℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72.0℃延伸10 min，4.0℃保存。

1.2.4 凝膠電泳

每個加樣孔中加入3 μL的PCR擴增產(chǎn)物，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠在160 V電壓下電泳分離，100 bp DNA Ladder作為標記。

1.2.5 染色

將凝膠從玻璃板中取出，在一角做個切口以標記方向。用水漂洗2次，銀染5～8 min，水漂洗1次，加顯影液，放到搖床機上直到出現(xiàn)清晰的條帶為止，用水清洗凝膠后照相。每個樣品3個重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

電泳圖譜中每條擴增帶代表引物的1對結(jié)合位點，且被視為有效的分子標記。同一引物的擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性。每對引物檢測到的每條多態(tài)性帶視為1個等位變異，將電泳圖譜中清晰的條帶（不包括弱帶）賦值為“1”，無帶時賦值為“0”，缺失時為“9”。利用NTSYS-pc2.10e系統(tǒng)軟件中DICE法計算遺傳相似系數(shù)，用UPGMA進行聚類分析。根據(jù)Smith等[20]報道的方法計算PIC（Polymorphism index content）值，多態(tài)性信息指數(shù)PIC的計算公式為：

PIC表示位點i的PIC值，Pij表示位點i的第j個等位位點出現(xiàn)的頻率，位點i的帶型為1～n，PIC值為0～1，0表示該位點無多態(tài)性，1表示該位點有許多等位位點。每個標記的多態(tài)性程度根據(jù)Botstein等[21]提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)性含量指標，當PIC>0.50時，該基因座為高度多態(tài)基因座，0.25

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物篩選

從50個陜西省主要茶樹資源中，選擇了6份有代表性的材料（龍井長葉、平陽特早、陜茶1號、丹桂、寧紫芽中葉、大腳板1）進行引物篩選，從125個SCoT引物中，綜合考慮PIC值大小、擴增帶型統(tǒng)計的難易及該引物的擴增實驗重現(xiàn)性高低，篩選出了38個擴增條帶清晰的SCoT引物用于遺傳多樣性研究。引物信息見表1。

2.2 SCoT標記的等位變異數(shù)和擴增片段多態(tài)性

38個SCoT引物在50份供試材料間共檢測出了414個等位變異，其中多態(tài)性條帶400個，多態(tài)性條帶的比率（PPB）為96.62%，平均每個SCoT引物檢測到11個等位變異，每個SCoT引物可檢測到的等位變異數(shù)目為4～17個不等。其中，引物SCoT33擴增出了17個等位變異，見圖1（其中11號金觀音和48號春雨1號在38個引物中均為擴增出條帶，因此在聚類分析是已將這兩個材料剔除。圖2同）。每個SCoT位點的PIC值變化在0.56～0.98之間（表1），平均值為0.89，38個SCoT位點為高度多態(tài)基因座。其中SCoT1、SCoT2、SCoT15、SCoT32引物的PIC值均達到0.98，圖2為SCoT15的擴增結(jié)果。PIC值能夠反映引物區(qū)分材料的能力，本研究選用的38個引物檢測出的基因型豐富，可區(qū)分所有材料，說明SCoT標記具有較高的鑒別能力，能應(yīng)用于茶樹品種鑒定。

2.3 SCoT標記分析的材料間遺傳相似系數(shù)

如圖3所示，基于SCoT標記數(shù)據(jù)的材料兩兩間遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.32～0.92，平均0.61。其中寧13-14紫芽中葉與碑壩12-1小葉相似系數(shù)最低（0.32），而碑壩12-3小葉和碑壩12-1間的相似系數(shù)最高（0.92）。48個供試材料兩兩計算其相似度，共獲得1128個遺傳相似系數(shù)，在以0.02為組距進行次數(shù)分布分析時，48個供試材料間的遺傳相似系數(shù)在0.59處分布密度最大，兩側(cè)不對稱。經(jīng)卡方測驗，不符合正態(tài)分布（P>0.01），呈左偏態(tài)分布。小于0.69的遺傳相似系數(shù)有873個（77.39%），大于0.69的有360個（22.61%）。主要分布在0.59～0.71之間，占52.84%（596/1128）。

2.4 SCoT標記的聚類分析

擴增出條帶的48份供試材料SCoT標記分析的遺傳相似系數(shù)和聚類如圖4所示，在相似系數(shù)為0.61處，將48份材料聚為三大類型。第一大類包括碑壩13-2小葉等12個材料；第二大類包括碑壩13-7小葉等27個材料；第三大類包括寧13-6中葉等9個材料。從聚類圖上看地方群體種大多聚類在一起，小部分與引進品種親緣關(guān)系近，這可能是在長期引種過程中群體種與引進品種混雜或自然雜交產(chǎn)生后代所致。

48份材料中29份當?shù)厝后w種聚類如圖5所示，在遺傳相似系數(shù)0.62處將29份當?shù)厝后w種聚為四大類，第一大類有碑壩13-2小葉等5個材料；第二大類有西13-16中葉和碑壩11-6柳葉共2個材料；第三大類有碑壩13-7小葉等15個材料；第四大類有寧13-6中葉等7個材料。聚類結(jié)果表明，碑壩、西鄉(xiāng)大河壩、寧強廣平及鎮(zhèn)巴4個縣的群體種并沒有完全按照地理分布聚類，大葉種基本聚類在一起。

表1　SCoT標記及其遺傳多態(tài)性信息含量Table 1 Polymorphism information content of SCoT marker

圖1　引物SCoT33的擴增結(jié)果

圖2　引物SCoT15的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of primer SCoT15

圖3　供試材料間遺傳相似系數(shù)的頻率分布直方圖Fig.3 Distribution of genetic similarity between materials

圖4　SCoT標記分析的遺傳相似系數(shù)數(shù)據(jù)構(gòu)建的48份茶樹資源的聚類分析Fig.4 Dendrogram of genetic similarity among 48 tea germplasm constituted by the information of genetic similarity coefficient analyzed by SCoT marker

圖5　SCoT標記分析的遺傳相似系數(shù)數(shù)據(jù)構(gòu)建的29份當?shù)夭铇淙后w種資源的聚類分析Fig.5 Dendrogram of genetic similarity among 29 tea germplasm constituted by the information of genetic similarity coefficient analyzed by SCoT marker

3 討論

分子標記技術(shù)是DNA水平上遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境及基因表達與否的限制，遍及整個基因組，遺傳穩(wěn)定，能夠克服形態(tài)學(xué)鑒定的很多困難。利用分子標記進行茶樹遺傳多樣性研究對育種工作具有重要意義，通過對品種間親緣關(guān)系的分析，可以指導(dǎo)育種親本的選擇。分子標記不受環(huán)境栽培因素的干擾，提高了品種鑒定的準確性，縮短了育種年限。SCoT標記是一種基于翻譯起始位點（Translation initiation site，TIS）的目標分子標記新技術(shù)，成本低、多態(tài)性高且穩(wěn)定，能有效產(chǎn)生和性狀相連鎖的標記，在茶樹遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、差異基因表達等研究方面都具有良好前景。

本研究首次將SCoT標記應(yīng)用于茶樹遺傳多樣性分析，在陜西種植茶樹品種資源中檢測出較高的遺傳多態(tài)性。由于SCoT標記擴增的可能是2個基因間的區(qū)域，因此擴增片段大小多集中在250～1 000 bp之間。50份供試材料的擴增片段多態(tài)性比率（PPB）為96.62% （400/414），遺傳相似系數(shù)大多集中在0.59～0.71之間，說明目前陜西省茶樹品種遺傳基礎(chǔ)寬泛，具有豐富的遺傳差異，擁有優(yōu)良的茶樹育種資源。研究結(jié)果表明，SCoT標記能夠較好地區(qū)分各材料，可用于篩選鑒定現(xiàn)有茶樹品種和育種材料，為育種工作提供有力幫助。

本研究聚類結(jié)果顯示，本地群體種大部分聚類在一起，引進品種聚類在一起，反映出群體種與引進品種之間的遺傳差異，具備開展本地品種系統(tǒng)選育的優(yōu)勢。對29份陜西當?shù)刂匾牡胤饺后w種單獨聚類發(fā)現(xiàn)，試供材料未嚴格按照來源地聚類，但西鄉(xiāng)群體種基本歸為相近的一類，不同茶區(qū)的大葉種聚為相近的一類。這可能是由于本地各茶區(qū)地理分布較近，茶樹起源于相同地區(qū)，隨后自然雜交形成多樣性豐富的群體種，SCoT標記聚類結(jié)果對本地群體種鑒定分類具有一定參考價值。

本研究通過SCoT分子標記技術(shù)在分子水平上分析了陜西茶樹品種的遺傳多樣性，為陜西茶樹種質(zhì)親緣關(guān)系研究，系統(tǒng)進化分析和遺傳多樣性評價奠定了基礎(chǔ)，也為陜西茶樹品種的系統(tǒng)選育提供了十分重要的理論依據(jù)。

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Genetic Diversity Analysis of Tea Germplasm in Shaanxi Province Based on SCoT Marker

CHEN Xi1,ZHANG Yu1*,LI Jiao2,XI Yanjun2,ZHANG Yanqing3
1.School of Biological Sciences and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000,China; 2.Hanzhong Institute of Agricultural Sciences,Hanzhong 723000,China; 3.Hanzhong Botanical Institute,Hanzhong 723000,China

Abstract:Genetic diversity of 50 tea germplasm materials in Shaanxi was investigated.Taking 6 representative Shaanxi tea germplasm materials as templates,38 of 121 SCoT marker primers were screened out,which showed specific bands and highly polymorphism.The results showed that SCoT markers could reveal high genetic diversity among tea germplasm,and each primer can detect out 4 to 17 alleles.On average,11 allelic variations could be detected by each SCoT marker.414 DNA fragments were amplified via 38 pairs of SCoT primer,of which 400 showed polymorphism and the ratio(PPB)was 96.62%.In addition,genetic polymorphism information content of each SCoT locus was between 0.56 and 0.99,the average of which was 0.90 for the tested materials,and the genetic similarity coefficient was between 0.59 and 0.71.The research showed that SCoT marker could be used in the genetic diversity research of tea germplasm.Basing on SCoT marker,genetic diversity level of these Shaanxi tea germplasms were relatively high in the genetic diversity.

Keywords:tea(Camellia sinensis),SCoT,diversity

作者簡介：陳熙，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。*通訊作者：zy68169@sina.com

基金項目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目（2013JZ008）、陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程（2013KTZB02-01-01）項目。

收稿日期：2015-08-12

修訂日期：2015-10-26

中圖分類號：S571.1；Q52

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-131-08