丁　濤，王　芳

(1.延安大學 陜西省化學反應工程重點實驗室，陜西 延安 716000；2.延安大學石油學院，陜西 延安 716000)

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一種用于監(jiān)控葡萄糖濃度的嵌入式光學生物傳感器

丁濤1，王芳2

(1.延安大學 陜西省化學反應工程重點實驗室，陜西 延安 716000；2.延安大學石油學院，陜西 延安 716000)

摘要：由于在持續(xù)流動條件下連續(xù)監(jiān)測血糖濃度較為困難，提出了2種硅橡膠(聚二甲基硅氧烷)光子生物傳感器設計方法，分別是內(nèi)部固定光子生物傳感器和對內(nèi)部固定光子生物傳感器進行改進，將微珠腔與玻璃粉填充渠道綜合的外部固定光子生物傳感器。結果顯示，前者內(nèi)部固定光子生物傳感器可檢測濃度為0.26～5.00 mg·L(-1)的葡萄糖，R2=0.9905；后者通過外部固定聯(lián)合方法固定大量的酶于玻璃粉上，加快了傳感器腔內(nèi)化學反應的速率，在連續(xù)流動情況下，可檢測濃度為0.7～10.0 mg·L(-1)的葡萄糖，R2=0.9845。外部固定光子生物傳感器在光子芯片實驗室的在線分析方面具有廣闊的應用前景。

關鍵詞：葡萄糖；酶；玻璃粉(微珠)；生物傳感器

采用微系統(tǒng)技術的微流體設備在生命科學和生物醫(yī)學領域有著獨特的應用。目前，面向于一臺集成在一個芯片上的微型化實驗室裝置或設備引起了許多研究人員的興趣，陸續(xù)出現(xiàn)了很多微型設備(如泵、加氣機、生物傳感器等)[1-2]。在這些設備中，微生物傳感器因對細胞、抗體、DNA和酶作用物(如葡萄糖、乙醇、過氧化氫等)的檢測效果極佳而對于芯片實驗室系統(tǒng)的發(fā)展影響重大[3]。

1962年，Clark和Lyons提出了葡萄糖酶電極[4]。自此，基于良好的經(jīng)濟前景預測，出現(xiàn)了很多葡萄糖生物傳感器的設計和檢測原理[5]。

第一代葡萄糖生物傳感器為葡萄糖氧化酶(GOX)傳感器[6]。GOX固定在聚丙烯酰胺凝膠上形成氣體滲透膜覆蓋電極[7]，用電化學方法檢測到氧氣濃度降低，以此作為葡萄糖濃度降低的指示器。

由于檢測的含氧量有波動，這種方法被電化學法檢測氧化產(chǎn)物過氧化氫所取代[8]。但是在較高的陽極電位下檢測過氧化氫或氧氣時，容易氧化相鄰的分子，導致這種生物傳感器無法完全準確地用于葡萄糖濃度的檢測。

為了解決這一難題，第二代傳感器應運而生，這種傳感器用其它濃度易控的氧化性介質取代氧氣[9]。它們可以使酶的活性部分與電極表面發(fā)生反應，并且以電子的形式穿梭于酶與電極之間。電化學信號的檢測取決于介質的氧化。這種系統(tǒng)使得傳感不依靠于氧氣，即如果系統(tǒng)中的氧不充分，葡萄糖濃度的檢測可以獨立于氧氣。

光學微芯片生物傳感器常用來與固定的葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶(GOX-HRP)、醇氧化酶-辣根過氧化物酶(AOX-HRP)聯(lián)合檢測產(chǎn)生于蔗糖與固定酵母細胞的動態(tài)的葡萄糖和乙醇。即連續(xù)不斷地監(jiān)測流過傳感器的固定聯(lián)合酶，這種酶可以催化一系列的反應，以HRP催化發(fā)光氨的氧化產(chǎn)生化學熒光結束。同時發(fā)現(xiàn)，GOX-HRP生物傳感器可以在正常情況下使用5d，而AOX-HRP傳感器需要不斷地校正以防止它隨著時間的推移而失去活性。

另一方面，已成功生產(chǎn)出在硅橡膠基片上使用硅橡膠導波管制造的完整的光學葡萄糖傳感器，并且得到測試。許多導波管用熱的方法制造成表面被處理過的PDM單塊集成電路導波管系統(tǒng)，并焊接在硅膠基片上[10]。然后它們被連接到一個發(fā)光二極管(LED)上，這個LED將波長小于450nm的光注入到導波管。在這個波段氧敏釕極易吸收染色并且發(fā)射波長小于610nm的光。這個傳感系統(tǒng)使氧敏染色三異丙基乙磺酰和葡萄糖酶相結合。這個染色/酶系統(tǒng)使用逐層自組裝的方法固定在導波管表面。染色/酶系統(tǒng)會與周圍環(huán)境發(fā)生反應產(chǎn)生變化，使用的監(jiān)控方法是檢測端面與被注入到導波管中的光發(fā)生的反應。這種傳感器整體靈敏度過低。傳感器的低靈敏度和熒光強度有關，原因是葉片脫模故障和大多數(shù)分光儀的靈敏度較低。

最近的研究表明，微型生物傳感器(如迷你/微米設備)具有快速分析、并行化、低成本、可移植性和微量的試劑消耗等優(yōu)點。這種技術基于內(nèi)外部聯(lián)合固定的GOX和HRP在光激性葡萄糖生物傳感器上得以實現(xiàn)。內(nèi)部的固定聯(lián)合是在內(nèi)部傳感器腔的硅橡膠表面，而外部的固定聯(lián)合是在功能化硅膠的微小顆粒上[11]。外部的微小顆粒固定有很多優(yōu)點，例如大的比表面積可以提高酶的活性。此外，大量的顆?？梢员还潭ǎm用于多種芯片。與每個測試硅橡膠芯片直接固定技術相比，這種技術可以降低成本、縮短實驗時間。

1原理

酶是具有生物催化功能的特殊蛋白質，可通過降低活化能加速生物化學反應，具有在不改變結構配置的情況下可以存活數(shù)反應周期的優(yōu)點。檢測葡萄糖使用了很多的組分酶，如GOX或葡萄糖脫氫酶。

GOX催化一系列的反應，使得基質被氧氣氧化產(chǎn)生過氧化氫。在富氧條件下，GOX催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫[4]。因此，通過檢測氧氣的消耗或者過氧化氫的生成，可以直接測定葡萄糖濃度。

在該研究中過氧化氫和HRP被看作是葡萄糖濃度測定的指示劑。HRP被廣泛應用在生物化學領域，通常催化過氧化氫與基底反應發(fā)生顯色或發(fā)光。反應式如下：

在所有實驗中，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)被當作一個基底。借助于光學測定TMB的氧化形式分析濃度。

2實驗

2.1材料與試劑

光阻SU-8 5和SU-8 50以及它們的甲基丙二醇溶液或醋酸酯(PGMEA)溶液，Micro Chem Corporation。彈性為184的硅橡膠硅酮樹脂，Dow Corning公司。

葡萄糖氧化酶(GOX，G7141-50KU產(chǎn)品)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、醋酸鹽緩沖溶液(pH=4.6)、辣根過氧化物酶(HRP，型號4)、醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、戊二醛，Sigma-Aldrich有限公司。

2.2傳感器的制備

光子葡萄糖生物傳感器采用紫外線(UV)光刻技術，使用SU-8光刻膠作為背面主體對硅橡膠模型進行軟光刻處理。主體在厚度700 μm的鈉石灰玻璃襯底上進行雙面光刻處理。制備過程是：先把基底放在120 ℃電烤爐中加熱1 h以清潔和脫水，然后在一個桶狀的蝕刻器中進行氧等離子體活化。

光刻工藝的第一步是在襯底上將SU-8 5以3 000 r·min-1旋涂30 s，在95 ℃下干燥10 min。之后SU-8層溢出暴露在紫外光下，在95 ℃下烤10 min，得到一層厚度約5 μm的膜，可充當一個粘附促進劑和種子層結構。在結構的旋轉涂布層之前, 種子層在氧等離子體中激活。

傳感器主體使用SU-8 50光刻膠處理雕刻2次，每次用4 mL光刻膠以1 200 r·min-1瞄準平面板捻成絲狀，然后在95 ℃下干燥，獲得一層總厚度為230 μm的基底，暴露在紫外光下100 s并且在95 ℃下烤20 min。暴露的主體靜置一夜后放入丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)中。

這個主體的復制品是用硅橡膠加工成型的，硅橡膠預聚合物是用體積比為1∶10的固化劑與彈性基礎混合。混合物除去氣泡后灌入主體內(nèi)部，在80 ℃下加熱30 min，最終從主體上剝落。硅橡膠生物傳感器模具固定在玻璃片上，然后連上進口和出口。

2.3固定聯(lián)合方法

酶(HRP,GOX)的固定聯(lián)合是直接影響葡萄糖傳感器性能的一個關鍵因素。很多固定聯(lián)合方法，如：簡單吸附法、共價鍵結合法[聚乙二醇(PEG)，在硅橡膠腔的內(nèi)表面，酶與外部的功能硅微粒以共價鍵結合]，都被檢查使用過。固定聯(lián)合方法直接影響到后續(xù)的操作。

2.3.1在硅橡膠上進行內(nèi)部的固定聯(lián)合

GOX和HRP直接共價固定在傳感器腔硅橡膠的內(nèi)表面。為了檢查硅橡膠表面有效酶的固定，有2個檢查程序：簡單的化學吸附法和聚乙二醇(PEG)/11-三乙氧基硅基十一醛(11-TESU)共價捆綁法。

化學吸附法是最簡單和快速的方法。在此過程中，0.001 mg HRP與0.001 mg GOX溶解在聚丁二酸丁二醇酯中，室溫下在傳感器腔中簡單培養(yǎng)1 h。

使用PEG實現(xiàn)其它程序的目的是表面處理中避免酶盲目地綁定在硅橡膠上，同時改善固定聯(lián)合的效果。PEG是一個線型高分子，結構簡單，化學性質穩(wěn)定，是一種惰性的具有生物相容性的物質。由于空間效應， PEG 表面排斥其它分子[12]。進入的分子不能被吸附，如靜電力和不能穿透含水的PEG層，導致惰性親水表面缺少“粘性”。PEG作為洗滌劑可防止非特異性酶(如HRP)與其表面結合[13]。

固定聯(lián)合過程首先要用乙醇和蒸餾水仔細清洗傳感器內(nèi)腔。之后，將1 mg的PEG/聚乙烯醇(PVA)溶解到1 mL蒸餾水中。PEG在水中可直接溶解，但PVA要溶解到熱水中。溶液在常溫下放到洗過的傳感器腔內(nèi)培養(yǎng)1 h。沖洗PEG/PVA，用2%三乙胺和2%11-TESU溶液進行鹽化作用。首先分別溶解1 mL三乙胺到45 mL蒸餾水中、溶解1.1 mL 11-TESU到48.9 mL乙醇中。然后將這2種溶液按1∶1充分混合，室溫下在系統(tǒng)中培養(yǎng)1 h。此前，系統(tǒng)用乙醇清洗過，并在電爐中80 ℃下加熱2 h。在此期間，將1 mg HRP、1 mg GOX和1 mg硼氫化鈉溶解在10 mL的聚丁二酸丁二醇酯中。最后將準備好的溶液在系統(tǒng)中培養(yǎng)1 h。

2.3.2在微珠上進行外部的固定聯(lián)合

外部固定聯(lián)合方法是將HRP和GOX共價固定在功能化的二氧化硅微珠表面。HRP和GOX首先被固定，然后微珠注入到微珠充填腔。

外部固定聯(lián)合首先將1.5 g二氧化硅微珠與10 mL 2.5%的戊二醛溶液混合并在室溫下振蕩90 min，然后加入2 倍的水混合充分。再用離心機全速分離10 min。丟棄懸浮層，重復進行3次。同時制備酶溶液，溶解10個單位的HRP和10個單位的GOX到0.1 mol·L-1的聚丁二酸丁二醇酯中。外部的固定聯(lián)合通過將酶溶液加到預先制備好的微珠并且在室溫下培養(yǎng)1 h完成。溶液4 ℃下保存，備用。

微珠表面的外部固定聯(lián)合比內(nèi)部固定聯(lián)合方法更有優(yōu)勢。相對體積來說，比表面積的高增長使得大量的酶在微珠表面固定聯(lián)合，尤其是在酶與被分析物的交互區(qū)固定聯(lián)合。這樣能使腔室內(nèi)的化學反應在數(shù)量和比率上具有很好的效果。除此之外，由于使用了戊二醛的解決方案，外部的固定聯(lián)合可提供強大的附著在微珠表面的共價酶。

2.4傳感器的設計

光學生物傳感器通過硅橡膠軟印法進行微制備，由玻璃基底和生物傳感器主體組成。

內(nèi)部生物傳感器主體由傳感器腔、流體入口、出口、分配以及光纖通道組成(圖1)。傳感器主體包括入口和出口通道，作用是使流體在傳感器內(nèi)部流動。流體分流通道的設計目的是使流體能夠均勻分布于傳感器腔室。光纖通道垂直布置在傳感器腔室，這些通道設計成扣件的形式，目的是在通道上更好地固定光纖，這些通道末端是兩面凹的鏡頭，借此光可以被集中，然后通過感受神經(jīng)纖維輸送結果。

外部生物傳感器主體是由傳感器腔、微珠腔、流體入口、出口和光纖通道組成(圖2)。微珠腔設計在入口側面，傳感器室和狹窄的網(wǎng)格接壤。固定化的微珠通過一個單獨的微珠充填通道連接到微珠腔，直接插入固定化的微珠。光纖通道垂直布置在傳感器腔的兩側，末端是兩面凹的微透鏡?？奂驮O計可以使光纖更平穩(wěn)地進入通道，兩面凹的微透鏡可以調整光纖的數(shù)值孔徑。

圖1　內(nèi)部生物傳感器的結構

圖2　外部生物傳感器的結構

3結果與討論

3.1測量裝置

光子生物傳感器表征實驗通過2個直徑為230 μm的多模光纖(光學元件，達豪，德國)、一個單色光源(S1FC635，光學元件)、一個分光儀進行。2個光纖首次插入到硅橡膠自調整光纖通道，一個連接光源，另一個連接分光器。因此，光-被分析物交互作用的光程與反應堆的寬度相同。如果被分析物在介質中被稀釋并且沒有二次發(fā)射的光子，這個光子生物傳感器的性能遵循比爾-朗伯定律——吸光度與光程、濃度和摩爾吸收率成正比。

3.2測試結果

在研究中，內(nèi)部和外部固定傳感器設計已經(jīng)通過測試。對于內(nèi)部固定設計，檢查程序：簡單的化學吸附法和PEG/PVA。

直接固定酶在硅橡膠表面，并用聚丁二酸丁二醇酯清洗系統(tǒng)，檢測簡單的化學吸附法。吸光度的測量以TMB作為媒介，在過氧化氫減少的情況下，該媒介變?yōu)榫G色。顏色的變化程度取決于光吸收，因此可提供關于葡萄糖濃度的信息。實驗中，葡萄糖以33 μL·h-1流速不斷被注入，在固定時間間隔內(nèi)記錄結果。結果表明，光學吸收測量結果波動很大，并且未獲得有效的測量值。這可能與缺少表面預處理而導致的表面酶綁定不確定有關。

因此，第二個方法先使用鹽化作用，然后采用PEG進行檢測。執(zhí)行與之前相同的檢測程序。繪制吸光度與葡萄糖濃度的關系曲線(圖3)，結果發(fā)現(xiàn)吸光度和葡萄糖濃度線性擬合良好，傳感器能夠檢測濃度為0.26～5.00 mg·L-1的葡萄糖，R2=0.9905。即表面修正和鹽化步驟是有效的，提高了傳感器的性能。

圖3　葡萄糖吸光度校準曲線(15 min)

然而大量固定的酶是受限的，影響生物傳感器檢測范圍。為了解決這一問題，改進了光子生物傳感器，并對玻璃粉腔進行測試。首先，充填通道玻璃粉腔被固定的微珠顆粒填滿，然后開始通道封閉檢測過程，使用同樣的測量方法。繪制吸光度與葡萄糖濃度的關系曲線(圖4)，結果發(fā)現(xiàn)吸光度與葡萄糖濃度線性擬合良好，傳感器能夠檢測濃度為0.7～10.0 mg·L-1的葡萄糖，R2=0.9845。

圖4　葡萄糖吸光度校準曲線(10 min)

外部固定傳感器與內(nèi)部設計相比提供了一個較寬的濃度測量范圍，平均能獲得多于一個的光譜。這個和高增長的固定比表面積有關，增加了固定在玻璃粉上的酶與被反應物之間的反應區(qū)域。表明，外部固定設計使用簡單，是一種有效的固定方法。此外，外部固定方法可以簡單地使不止一種酶固定在玻璃粉表面，不同的基底都可以被檢測。從獲得的光子結果推斷，使用戊二醛作為外部固定酶到玻璃粉的交聯(lián)劑，可以提高捆綁酶到玻璃粉的強度，對于增強基底的活性與特異性有著積極的影響。這與構造的維護保養(yǎng)、酶的活性部位和酶在固定步驟中非常細微的改變有關。

在傳感器的設計過程中，使用固化方法對生物傳感器的敏感性和性能都會產(chǎn)生較大的影響。

4結論

提出了2種在持續(xù)流動條件下基于內(nèi)部與外部固定聯(lián)合的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過氧化物酶(HRP)的光子葡萄糖生物傳感器設計。結果表明，內(nèi)部光子生物傳感器設計可檢測濃度為0.26～5.00 mg·L-1的葡萄糖，相關系數(shù)為0.9905；通過外部固定聯(lián)合方法能夠固定大量的酶共價于玻璃粉，加快了傳感器腔內(nèi)化學反應的速率，在連續(xù)流動情況下，可檢測濃度為0.7～10.0 mg·L-1的葡萄糖，相關系數(shù)為0.9845。該傳感器在光子芯片實驗室系統(tǒng)的在線分析方面具有廣闊的應用前景。

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A Kind of Embedded Optical Biosensor Used to Monitor Glucose Concentration

DING Tao1,WANG Fang2

(1.ShaanxiKeyLaboratoryofChemicalReactionEngineering,Yan′anUniversity,Yan′an716000,China；2.SchoolofPetroleum,Yan′anUniversity,Yan′an716000,China)

Abstract：Since it is difficult for continuously monitoring blood sugar in a steady flow,two silicon rubber (PDMS) photonic biosensors were proposed in this paper.One is an internal fixed sensor and the other is a modified version of this sensor,i.e.,the beads cavity with glass powder filling composite in the sensor channels.Results showed that，the internal fixed sensor could detect glucose in the concentrations region of 0.26～5.00 mg·L(-1) with R2 of 0.9905.The external immobilization method offered the possibility of covalently immobilizing huge amount of enzymes to micro-beads,which promoted the rate of chemical reaction taking place inside the biosensor cavity.External fixed sensor could detect glucose in the concentrations region of 0.7～10.0 mg·L(-1) with R2 of 0.9845 under a continuous flow.The results have a good application prospect in photon system online analysis.

Keywords：glucose;enzyme;micro-bead;biosensor

中圖分類號：O 657.3

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0063-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.017

收稿日期：2015-11-07

作者簡介：丁濤(1982-)，男，陜西渭南人，講師，研究方向：微傳感器設計，E-mail:dtguokong2013@163.com。

基金項目：陜西省教育廳自然科學專項(15JK1808)