馮丹陽　王力明

710032　西安市，西安電力中心醫(yī)院

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·論著·

阿托伐他汀對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞炎癥相關(guān)基因mRNA水平的影響

馮丹陽王力明

710032西安市，西安電力中心醫(yī)院

【摘要】目的建立檢測(cè)人培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞炎性因子實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，觀察阿托伐他汀對(duì)相關(guān)炎性因子mRNA表達(dá)的影響。方法無菌采集志愿者靜脈血15 ml，進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，提取細(xì)胞總RNA及濃度純度鑒定，用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)PBL細(xì)胞 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，在培養(yǎng)體系中加入阿托伐他汀,與常規(guī)培養(yǎng)PBL的 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較。結(jié)果在經(jīng)過阿托伐他汀培養(yǎng)后，人外周血淋巴細(xì)胞的CCL13、IL-8、PAI-1、TGF-2的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05); 人外周血淋巴細(xì)胞的羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的mRNA表達(dá)顯著上升(P<0.05)，并且PBL中的低密度脂蛋白受體(LDL-R)數(shù)量也有明顯的增加趨勢(shì)(P<0.05)。在低濃度時(shí)24 h治療后阿托伐他汀能顯著降低CCL13的mRNA表達(dá)(P<0.05)，而在高濃度的阿托伐他汀時(shí)表達(dá)CCL13 的mRNA表達(dá)增加(P<0.05);CCL13 mRNA表達(dá)下調(diào)有一定時(shí)間依賴性(P<0.05)。結(jié)論他汀類通過直接抑制一些趨化因子和細(xì)胞因子在外周血淋巴細(xì)胞中的炎性基因表達(dá)，對(duì)預(yù)防臨床心血管疾病有一定作用。

【關(guān)鍵詞】阿托伐醌;淋巴細(xì)胞;炎癥

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CAD)，無論是心肌梗死、心絞痛、冠心病、心律失?；蛐呐K衰竭都嚴(yán)重威脅著患者的健康和生命。但CAD啟動(dòng)和發(fā)展機(jī)制迄今仍未完全闡明。動(dòng)脈粥樣硬化是CAD的病理基礎(chǔ)。除CAD的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、胰島素、年齡、性別、吸煙、肥胖等外，炎癥活動(dòng)在CAD發(fā)生發(fā)展中的意義正日益受到關(guān)注。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)證明，在給予他汀類藥物進(jìn)行治療后心血管炎癥的癥狀有明顯的改善[1]。他汀類藥物的治療效果也許遠(yuǎn)不止于以往人們預(yù)期的僅在降低血脂中的作用。阿托伐他汀是目前國內(nèi)最新一代他汀類藥物，為烈性羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，流行病學(xué)資料顯示，他汀類藥物降低血清超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平，降低高HsCRP、高膽固醇患者的病死率，并能有效改善急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者的預(yù)后，該效應(yīng)除與他汀類調(diào)脂作用有關(guān)外，還和其非調(diào)脂作用密切相關(guān)。研究表明，他汀類藥物抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制除了其有效的減低低密度脂蛋白(LDL)以外，還具有抗炎癥作用[1，2]。本研究的目的是要說明，在炎癥基因表達(dá)與阿伐他汀孵化后，烈性HMG-CoA還原酶抑制劑在PBL中的變化 ，利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction， PCR)技術(shù)，以進(jìn)一步研究他汀類的藥物的抗炎機(jī)制。PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)來自于用肝素抗凝后再用淋巴細(xì)胞分離劑(Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)從健康志愿者無菌靜脈血(15 ml)中分離出來的。

1.2外周血淋巴細(xì)胞采集與培養(yǎng)(1)無菌采集志愿者靜脈血15 ml，經(jīng)肝素抗凝(每毫升血用15 U肝素抗凝)，用不含血清的RPMI1640等體積稀釋。(2)加人淋巴細(xì)胞分離液(約20℃)6 ml于無菌離心管，沿管壁將抗凝稀釋血液緩慢加至分離液層面，保持勿使血液進(jìn)入分離液內(nèi)。(3)將離心管置水平離心機(jī)內(nèi)，室溫以2 000 r/min離心20 min，小心用吸管吸出灰白色層細(xì)胞，即外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，移入另一無菌離心管中。(4)用5倍體積PBS洗滌3次，每次于室溫以1 500 r/min離心10 min。(5)用RPMI-1640 溶液(Gibco Life Technologies) 洗滌1次，于室溫以1 500 r/min離心10 min。(6)用吸管輕輕吸取上層細(xì)胞懸液，即為除去單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)入無菌24孔板，供加藥培養(yǎng)。(7)用吸管輕輕吸取上層細(xì)胞懸液，即為除去單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于加入10%的胎牛血清(FCS)和1%青霉素或者鏈霉素(Penicilin or Stmycin，P/S)的RPMI-1640溶液的 35 mm的無菌培養(yǎng)皿上。(8)3 107個(gè)細(xì)胞被分為10組，給藥組分別加入溶解于二甲基亞砜(DMSO,SIGMA,St.Louis,MO)的阿托伐他汀5、10、20 mg/L，不加入阿托伐他汀為陰性對(duì)照組。置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞總RNA提取(1)RNA的提取:在培養(yǎng)8、16、24 h后，分別用Trizol(Invitrogen,Tokyo,Japan)提取總RNA 1 300×g離心10 min收集加藥孵育8、16、24 h后的細(xì)胞沉淀，徹底棄上清，加入1 ml RNAex試劑，用加樣移液器抽打5次，移至1.5 ml EP管。(2)室溫靜置10 min，加入200 μl氯仿，用力顛倒EP管混勻。室溫靜置10 min，4℃ 12 000×g離心10 min。(3)用小體積移液器小心將上層水相(約450 μl)移至另一1.5 ml EP管，加入等體積的異丙醇，混勻室溫靜置10 min。(4)4℃ 12 000×g離心5 min，小心棄上清。(5)用預(yù)冷75%乙醇1 ml洗滌沉淀，4℃ 7 500×g離心5 min，棄上清。(6)室溫靜置使RNA沉淀恰好干燥，加入20 μl無RNA酶水充分溶解，保存于-80℃。

1.4RNA的濃度及純度鑒定

1.4.1RNA濃度和純度的測(cè)定:取1 μl RNA液溶于99 μl純水中稀釋，用多功能酶標(biāo)儀分別在260 nm和280 nm處測(cè)定其吸光度A260和A280值。

1.4.2RNA濃度和純度:RNA濃度(μg/μl)=A260×40×稀釋倍數(shù)/1 000；RNA的純度用A260/A280的比值反映，要求在1.7～2.0。

1.5實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析絕對(duì)定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)： 2 μg總RNA樣品中加入隨機(jī)引物和鼠莫洛尼(氏)白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶使得最總體積為20 μl合成cDNA。用引物直接插入到pGEM-T Easy載體使之成為PCR擴(kuò)增嵌入物，此PCR擴(kuò)增嵌入物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，用MagExtractor質(zhì)粒試劑盒(Toyobo, Osaka, Japan)分離重組質(zhì)粒。稀釋質(zhì)粒和cDNA再加上用于制造質(zhì)粒的同一引物對(duì)以及LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Premix Ex Taq (Takara, Otsu, Japan)通過帶有l(wèi)ightcycler (Roche)的實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。 經(jīng)95℃初步變性步驟10 min，執(zhí)行周期數(shù)為45的一個(gè)三步驟的循環(huán)程序(其中95℃變性10 s，62℃退火10 s以及72℃延伸13 s)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法用LightCycler 軟件計(jì)算轉(zhuǎn)錄的絕對(duì)拷貝數(shù)量。以定量RT-PCR分析為條件的培養(yǎng)細(xì)胞的cDNA與作為內(nèi)部對(duì)照的膽色素原脫氨酶mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其結(jié)果用ABI序列檢測(cè)軟件2.1版的2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析作為相對(duì)定量。相對(duì)定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：用2 μg總RNA樣品以及RevertAidTM H Minus Frist Strand cDNA Synthesis試劑盒(fermentas)使得最終體積為20 μl 合成培養(yǎng)細(xì)胞的cDNA。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，對(duì)重復(fù)樣品用Applied Biosystems 7300 PCR實(shí)時(shí)系統(tǒng)與引物Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosysterm,U.S.)。見表1。

表1　RT-PCR引物列表

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1阿托伐他汀對(duì)人外周血炎性因子影響：為了估計(jì)阿托伐他汀對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的影響，2組細(xì)胞分別以5 mg/L的阿托伐他汀和無阿托伐他汀培養(yǎng)24 h后，收集和提取細(xì)胞總RNA。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)炎性基因的絕對(duì)拷貝數(shù)并與陰性對(duì)照計(jì)算減少數(shù)量。

1.6.2阿托伐他汀對(duì)HMG-CoA和LDL受體的影響：2組細(xì)胞分別以5 mg/L的阿托伐他汀和無阿托伐他汀培養(yǎng)24 h后，收集和提取細(xì)胞總RNA。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)LDL受體和HMG-CoA的絕對(duì)拷貝數(shù)。

1.6.3外周血淋巴細(xì)胞對(duì)阿托伐他汀的時(shí)間依賴和劑量依賴：在阿托伐他汀治療后，分別在8、16、24 h時(shí)分析實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，ccl13的mRNA水平濃度分別為5、10、20 mg/L。

2結(jié)果

2.1阿托伐他汀對(duì)外周血炎性因子的影響在經(jīng)過阿托伐他汀培養(yǎng)后，人外周血淋巴細(xì)胞的CCL13、IL-8、PAI-1、TGF-2的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1　阿托伐他汀對(duì)人外周血炎性因子的影響

2.2阿托伐他汀對(duì)HMG-CoA和LDL受體的影響在經(jīng)過阿托伐他汀培養(yǎng)后，人外周血淋巴細(xì)胞的HMG-CoA的mRNA表達(dá)顯著上升，并且PBL中的LDL受體數(shù)量也有明顯的的增加趨勢(shì)(P<0.05)。見圖2。

圖2　阿托伐他汀對(duì)HMG-CoA和低密度脂蛋白受體的影響

2.3阿托伐他汀治療后PBL中CCL13的mRNA水平隨劑量復(fù)化在低濃度時(shí)24 h治療后阿托伐他汀能顯著降低CCL13的mRNA表達(dá)，而在高濃度的阿托伐他汀時(shí)表達(dá)CCL13 的mRNA表達(dá)增加。見圖3。

圖3　在阿托伐他汀治療后PBL中CCL13的mRNA水平隨劑量變化

2.4阿托伐他汀治療后PBL中CCL13的mRNA水平隨時(shí)可變化研究結(jié)果表明CCL13 mRNA表達(dá)下調(diào)有一定時(shí)間依賴性。見圖4。

圖4　在阿托伐他汀治療后PBL中CCL13的mRNA水平隨時(shí)間變化

3討論

急性心肌梗死(AMI)是CAD的主要類型。AMI發(fā)生后常伴有梗死區(qū)及其周邊區(qū)的炎性反應(yīng)，并由纖維組織逐漸取代原梗死區(qū)內(nèi)壞死自肌組織，形成癱痕修復(fù)。干預(yù)這一炎癥過程，可能會(huì)對(duì)AMI后心功能改善產(chǎn)生有益的作用，同時(shí)也可能有不利的影響。AMI臨床治療中干預(yù)該炎癥過程是一個(gè)待開發(fā)的領(lǐng)域。

在高膽固醇血癥患者的血清中的某些炎癥趨化因子(IL-1，IL-6，TNF-α)有升高的現(xiàn)象[2]。臨床研究表明，血漿中這些細(xì)胞因子的上調(diào)水平和心血管疾病的增長(zhǎng)有關(guān)[2]。 T-淋巴細(xì)胞的活化在炎癥發(fā)生過程中起著及其重要的作用。人單核細(xì)胞趨化因子4(CCL13)基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂Cys-Cys (CC)細(xì)胞因子基因簇中。細(xì)胞因子是參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的一類分泌蛋白家族。CC細(xì)胞因子具有特征性的兩個(gè)臨近半胱氨酸。CCL13對(duì)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞有趨化活性，但對(duì)嗜中性粒細(xì)胞沒有趨化活性。這一趨化因子在過敏及非過敏性炎性反應(yīng)中起到聚集白細(xì)胞的作用，也有可能在動(dòng)脈粥樣硬化中起到單核細(xì)胞招募的作用。研究表明，CCL13在遺傳過敏性皮炎的發(fā)病早期和正常組織中的轉(zhuǎn)錄存在差異，這對(duì)于遺傳過敏性皮炎的研究具有一定意義[2]。

他汀類藥物抑制羥甲戊二酰輔酶A(HMG-CoA)和膽固醇的合成，上調(diào)LDL感受器從而提高動(dòng)脈粥樣硬化患者的個(gè)體存活率[3]。此外，其他活性有待進(jìn)一步證明，包括內(nèi)皮細(xì)胞功能的改進(jìn)[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、增加纖維蛋白的溶解[6]、血栓癥[7]以及糖尿病等。無論他汀類是否可能產(chǎn)生有益的改造，在培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的基因表達(dá)譜中，都可發(fā)揮重要作用。

最近的研究表明，他汀類降低致炎細(xì)胞因子 (TNF,IL-1,IL-6,IL-8,TGF-1,PAI-1)和趨化因子(CCL2)的表達(dá)[8-10]。相似于我們的研究結(jié)果，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，他汀類治療后，IL-8、CCL2 和 PAI-1的基因表達(dá)被抑制，而HMG-CoA 和 LDL-R的表達(dá)增加，推測(cè)由于他汀類多效性的影響，固醇介導(dǎo)調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，或參與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。所有這些效應(yīng)很可能有助于防止動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。

趨化因子是一類控制涉及到各方面的炎癥應(yīng)答反應(yīng)的免疫細(xì)胞移行和激活的蛋白質(zhì)。他們已經(jīng)確定為C、CC、CXC和CX3C亞科。 CCL2(單核細(xì)胞趨化蛋白-1的MCP-1)，一個(gè)典型的促炎性趨化因子，在招募單核細(xì)胞到損傷和炎癥部位的過程中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道，阿托伐他汀能夠降低急性冠脈患者血漿CCL2的含量。CCL7(MCP-3)能抑制粒細(xì)胞的招募并且與多項(xiàng)免疫性疾病有關(guān)[11]。

在系統(tǒng)性硬化癥早期階段，CCL7的過度表達(dá)表明它促進(jìn)炎性細(xì)胞反應(yīng)并且在炎癥過程中招募巨噬細(xì)胞[12]。CCL13 (MCP的-4)，是有關(guān)于免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程的一種分泌蛋白CCL18(肺活化調(diào)節(jié)趨化因子)，是與巨噬細(xì)胞炎性蛋白1 α最具有同一性的[12]。 CXCL1有血管原活性[13]。已有報(bào)道表明細(xì)胞因子IL-1α,IL-6 和 IL-8日已被確定為促炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，它們?cè)诎⑼蟹ニ≈委熀蟮母吣懝檀佳Y患者血漿中的水平下降[14]，這正和我們從這項(xiàng)研究中得到的結(jié)論一致。這些都表明，阿伐他汀的抗發(fā)炎作用可能與直接抑制一些炎性趨化因子和細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)了與炎性反應(yīng)相關(guān)的新基因幾個(gè)新基因，如PAI-2 (纖溶酶原激活物抑制因子-2)，主要在活性炎癥單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的主要產(chǎn)物，是已被證明的外尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)的抑制劑，參與抵抗細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[15]。SOCS2(抑制細(xì)胞因子的信號(hào)-2)是一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)激素信號(hào)[16]。TGFβ1和TGFβ2(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和β2)是管理增殖、分化和組織修復(fù)的多效肽[17]。TGF-β的整合素介導(dǎo)局部活化對(duì)急性肺損傷肺水腫的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的[18]，因此，TGF-β的封鎖或活化可能是有效的臨床治療手段。

總之，我們的初步結(jié)果表明，他汀類由于能夠影響培養(yǎng)24 h的炎性細(xì)胞的基因表達(dá)，所以在臨床上是有效的。通過直接抑制一些趨化因子和細(xì)胞因子在外周血淋巴細(xì)胞中的炎癥基因表達(dá)而預(yù)防臨床心血管疾病時(shí)，阿托伐他汀可能是有貢獻(xiàn)的。

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Effect of atorvastatin on the levels of inflammation-related factors mRNA in human peripheral blood lymphocyte in vitro

FENGDanyang,WANGLiming.

Xi’anElectricityCentralHospital,Xi’an710032,China

【Abstract】ObjectivesTo observe the effects of atorvastatin on the levels of inflammation-related factors mRNA in human peripheral blood lymphocyte (PBL) in vitro.MethodsThe venous blood 15ml of volunteers was collected and PBL was separated and cultured in vitro,then,the total RNA of cells was extracted and identified for its density and purity.The expression levels of inflammation-related factors mRNA were dynamically detected by Real-time PCR. The results were analyzed and compared between atorvastatin group and control group.ResultsAfter PBL was cultured in the medium with atorvastatin,the expression levels of CCL13,IL-8,PAI-1,TGF-2 mRNA were significantly decreased (P<0.05),however, the expression levels of HMG-CoA mRNA were obviously increased (P<0.05),furthermore, the numbers of low density lipoprotein receptor (LDL-R) were significantly increased (P<0.05). After 24-hour treatment with low-dose atorvastatin,the expression levels of CCL13 mRNA were significantly obviously decreased (P<0.05), however,the expression levels of CCL13 mRNA in high-dose atorvastatin were increased (P<0.05),moreover,the down-regulation of expressions of CCL13 mRNA was time-dependent at some extent (P<0.05).ConclusionThe statins can inhibit the expressions of inflammation genes of some chemotactic factors and cytokines in PBL,thus,which play a certain role in preventing cardiovascular events in clinic.

【Key words】atovaquone;peripheral blood lymphocyte;inflammation

(收稿日期：2015-09-22)

【中圖分類號(hào)】R 331.125

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)06-0816-05

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.004