楊立軍　鄭文武　周安傳　蘇曉哲　吳亞東　李珅

050051　河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科

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·綜述與講座·

Livin蛋白生物學(xué)特性及在腫瘤表達(dá)中的研究進(jìn)展

楊立軍鄭文武周安傳蘇曉哲吳亞東李珅

050051河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科

【摘要】Livin具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用，因此對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究有重要意義。本文對(duì)Livin基因及蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和組織分布、抗細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制進(jìn)行闡述，同時(shí)對(duì)Livin在黑色素瘤、肺癌、絨毛膜細(xì)胞癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、膀胱移行細(xì)胞癌的關(guān)系進(jìn)行闡述，為臨床指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】Livin蛋白；生物學(xué)；腫瘤

凋亡抑制蛋白(IAP)是一類內(nèi)源性抑制因子，其過度表達(dá)引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。鑒于Livin具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用,人們開始關(guān)注其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。有學(xué)者采用Northernblot或RT-PCR方法,證實(shí)LivinmRN在人多種類型的腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá),包括黑色素瘤(MeWo, A375, G361, SK Mel29),淋巴瘤(Ramos, Raji)、大腸癌(HT29, HT29MTX),前列腺癌(PC3, DU145),白血病(K562, HL60, Jurkat, MOLT4)及頭頸部肉瘤(HeLa)等[1-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道以Livin基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi技術(shù)也可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達(dá)，使得caspase-3活化，明顯增強(qiáng)各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率[4]。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果，包括促進(jìn)化療藥物的促凋亡作用[2,3]。近年來, Livin基因在膀胱移行細(xì)胞癌的診斷治療及預(yù)后方面的研究日益深入，本文就其蛋白生物學(xué)特性及與腫瘤，尤其是膀胱移行細(xì)胞癌關(guān)系做一綜述。

1Livin蛋白概述

1.1Livin基因及蛋白結(jié)構(gòu)Livin是由 4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)小組采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法,分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到[1]。Kasof 等[2]將該基因命名為Livin。Lin等[3]由人胎腎cDNA文庫中分離到該基因,故將其稱為KIAP(kidneyIAP );Vucic等[5]因發(fā)現(xiàn)該基因在人黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)較高,所以稱之為ML-IAP(melanoma IAP);Ashhab等[6]發(fā)現(xiàn)了該基因存在2個(gè)剪接變異體,分別命名為Livinα和Livinβ，我們將其統(tǒng)稱為Livin。Livin基因位于人染色體20q13.3,全長4.6 kb,包含7個(gè)外顯子?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長1.4 kb,這與Livin全長cDNA大小一致。此外還發(fā)現(xiàn)存在長約2.2 kb、2.8 kb 和4.0 kb的轉(zhuǎn)錄子,這可能與mRNA3′端非翻譯區(qū)多腺苷酸化或存在未剪接加工成熟的前體RNA有關(guān)。Livin蛋白N端僅包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu),C端含一個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。Livinα和Livinβ分別由298和280個(gè)氨基酸組成,二者相差的18個(gè)氨基酸由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5′端54 bp的基因序列編碼。Livin氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合，以穩(wěn)定整個(gè)重疊結(jié)構(gòu)。Livinα和Livinβ蛋白分子量分別為39 000和37 000[2,3,5,6]。

1.2Livin的細(xì)胞和組織分布Kasof等[2]用含有Livin基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并檢測其表達(dá)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核與胞漿內(nèi)同時(shí)成纖維細(xì)絲樣染色，由此可知Livin同時(shí)呈絲狀表達(dá)與胞質(zhì)和胞核。Hariu等[7]用免疫組織化學(xué)染色檢測肺癌細(xì)胞顯示Livin蛋白在胞核和胞漿內(nèi)均有顯色。Vuvic等[8]通過研究乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Livin C末端RING結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)結(jié)合，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，而不在紡錘體上。而Ka和Hunt對(duì)不同時(shí)期的胎盤、滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞系以免疫組織化學(xué)法染色，陽性染色僅位于胞核。目前，Livin在細(xì)胞內(nèi)的定位尚無定論。Livin在正常成人較高表達(dá)的組織有心、肺、脾、卵巢、胎盤及胎兒的腦、腎組織，而在表皮、淋巴、胎兒的心臟中低表達(dá)。兩種亞型的組織分布不同，Livinα主要表達(dá)于腦、骨骼肌及外周血淋巴細(xì)胞，Livinβ主要表達(dá)于胎兒的心、胸腺以及成人和胎兒的腎[6]，Livin在正常組織中的表達(dá)分布仍需進(jìn)一步研究。

2Livin抗細(xì)胞凋亡作用和機(jī)制

2.1抗死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用Vucic等[5]將Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細(xì)胞,證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)Fas, TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1),DR4(death receptor 4)及DR5介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。Kasof等[2]將Livin基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞可有效阻斷由FADD (Fasasociatedproteinwithdeathdomain),Bax,RIP,RIP3及DR6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在Jurkat人T淋巴細(xì)胞株中,Livin可明顯抑制由TNFα及抗CD95抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,其抗細(xì)胞凋亡作用強(qiáng)于Bcl-2[6]。另有研究表明BIR結(jié)構(gòu)的完整在Livin抗細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[2,5]。

2.2抗線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用星狀孢子素(Staurosporine,STS)是一種蛋白激酶C(PKC)抑制劑,可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C,后者可進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡的下游通路。Livinα對(duì)STS誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出一定的抑制作用,但作用弱于Bcl-2;而Livinβ則無此作用,顯示了Livinα和Livinβ的抗細(xì)胞凋亡作用存在不同[6]?？够熕幬锝閷?dǎo)的細(xì)胞凋亡作用:許多化療藥物可引起細(xì)胞DNA的損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細(xì)胞可有效對(duì)抗阿霉素,4TBP4(4 terttiarybutyiphenol)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[5]。Livinβ可明顯抑制依托泊苷(etoposide)誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡[6]。

2.3抑制Caspase途徑Livin可與激活形式的Caspase3和Caspase7結(jié)合,并抑制其生物活性。Livin還可與未加工的或斷裂形式存在的Caspase9結(jié)合,抑制由Apaf1(apoptosis protein activating factor 1),細(xì)胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase9激活作用。Livin與Cspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性,這有賴于其BIR結(jié)構(gòu)域的完整,BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個(gè)氨基酸的突變即可影響Livin與Caspase的結(jié)合并使Livin抗細(xì)胞凋亡作用明顯降低甚至完全喪失[2,5]。

2.4激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑Livinβ可激活MAP(mitogen activated protern)激酶JNK1和JNK2,而Livin對(duì)JNK1的激活作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于JNK2,并且是Livin對(duì)抗TNFα和ICE介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的一條重要途徑。JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活,但Livin對(duì)JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號(hào)途徑,而是通過TAB1/TAK1途徑實(shí)現(xiàn)。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應(yīng)子(coactivator),TAB1本身對(duì)于JNK1無激活作用,但可促進(jìn)TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。Livinβ可與TAB1結(jié)合,并進(jìn)一步激活TAK1[9]。此外,SMAC(second mitochondrial activator of caspases)及活性肽片段可與Livin的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合,抑制Livin與caspase的結(jié)合及其抗細(xì)胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導(dǎo)的對(duì)Livin抗細(xì)胞凋亡作用的負(fù)性凋節(jié)機(jī)制[10]。

3Livin在腫瘤表達(dá)的相關(guān)研究

多種腫瘤細(xì)胞中Livin呈現(xiàn)陽性表達(dá)，其中黑色素瘤細(xì)胞系(G36，和SK-Mel29)中表達(dá)水平最高，提示該基因可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

3.2肺癌Vucic等[8]用Northern blotting檢測到Livin在肺癌中呈現(xiàn)陽性表達(dá)。Tanabe等[13]對(duì)非小細(xì)胞肺癌和非肺癌組織進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，前者Livin陽性表達(dá)率顯著高于后者(76.3% vs 6.7%，P<0.05)。Hariu等[7]以類似方法檢測肺腺癌、鱗瘤、大細(xì)胞癌的陽性率分別為75%、70%、100%，認(rèn)為Livin表達(dá)于大多數(shù)肺癌組織，與腫瘤的組織類型無關(guān)。鱗癌和腺癌的陽性染色均與組織中T細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)呈正相關(guān)。在化療藥物耐受的肺癌細(xì)胞中Livin蛋白表達(dá)水平較高，提示Livin可能作為腫瘤的標(biāo)記物和腫瘤免疫的靶向。孫建國等[14]對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行異構(gòu)體檢測發(fā)現(xiàn)Livinβ表達(dá)顯著低于Livinα(P<0.05)。放化治療后組織中Livin表達(dá)陽性率顯著升高(43.5%)。在腺癌尤為明顯，推斷在化療藥物和放射線誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，癌細(xì)胞合成表達(dá)抗凋亡的因子從而發(fā)生凋亡耐受，可能是臨床上肺腺癌發(fā)生耐藥的機(jī)制之一。術(shù)前已有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織Livin表達(dá)率(33.3%)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，但因樣本量偏少差異不顯著。結(jié)果顯示，凋亡抑制蛋白Livin在NSCLC表達(dá)，尤其是在肺腺癌患者中表達(dá)較高，不僅可作為肺腺癌的分子標(biāo)志物，還有助于肺癌的診斷和組織分型。

3.3絨毛膜細(xì)胞癌Ka等[15]對(duì)早晚期妊娠胎盤通

過免疫印跡法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)無Livin表達(dá)，可能與胎盤中含量低或檢測方法不敏感所致。免疫組織化學(xué)染色得到與陰性對(duì)照明顯不同的陽性表達(dá)，且僅僅表達(dá)于胞核。免疫活性蛋白在絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層的胞核內(nèi)均可檢測到，以后者為最低。Livin在絨毛膜癌細(xì)胞中含量比在正常滋養(yǎng)層細(xì)胞中更為豐富。認(rèn)為Livin和其他抗凋亡因子一樣，保證了絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞有絲分裂得以完整進(jìn)行，在滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖中起了重要作用。

3.4消化系惡性腫瘤Livin在消化系腫瘤患者高表達(dá)，與人消化系腫瘤的發(fā)生存在一定關(guān)系。Westem blotting研究顯示，Livin在胰腺癌AsPC-1株和結(jié)腸癌HT-29的表達(dá)最強(qiáng)，與GAPDH對(duì)照組中mRNA含量之比分別為0.78, 0.42。在胰腺癌細(xì)胞MIAPaCa-2和BxPC-3,胃癌細(xì)胞MKN-1以及結(jié)腸癌細(xì)胞LSI180和SW620中無表達(dá)。另外，對(duì)35例病理確診的胃腸癌患者的血清ELISA檢測Livin抗體，17例呈陽性反應(yīng)，陽性率為47%。15例胃癌患者中6例血清(7例Ⅲ期中4例，2例Ⅳ期中1例，復(fù)發(fā)胃癌1例)與Livin蛋白有反應(yīng)。胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和肝癌細(xì)胞Livin mRNA均過度表達(dá)，以胃腸癌檢出率相對(duì)較高(47%)，甚至高于抗survivin(40%)。與抗survivin抗體缺少相關(guān)性，表明對(duì)抗體Livin的檢測可以用作癌癥的檢出，Livin可作為一種新型的癌抗原。除了上述惡性腫瘤外。Livin在多數(shù)腫瘤中均有表達(dá)。

3.5Livin在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)與關(guān)系Gazzaniga等[16]研究發(fā)現(xiàn)正常旁膚組織無Livin基因表達(dá)，而腫瘤組織中Livinα表達(dá)陽性率為23%，但無β亞型表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)Livinα表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分期、級(jí)別及轉(zhuǎn)移程度均無關(guān)。Livinα表達(dá)陽性的患者術(shù)后腫瘤平均復(fù)發(fā)時(shí)間(3.5個(gè)月)遠(yuǎn)少于livinα表達(dá)陰性的患者(27.2個(gè)月)，復(fù)發(fā)間隔時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，提示Livinα表達(dá)是早期淺表膀膚癌預(yù)后不良的標(biāo)志，可作為膀膚癌復(fù)發(fā)的監(jiān)測指標(biāo)。Livinα在膀膚癌的復(fù)發(fā)早期時(shí)表達(dá)，推測Livinα與其他抗凋亡因子共同在化療誘導(dǎo)凋亡的耐受機(jī)制中發(fā)揮作用，但由于陽性例數(shù)不多，尚不足以斷定該基因在腫瘤中的表達(dá)可干擾化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。國內(nèi)何遠(yuǎn)橋等[17]研究發(fā)現(xiàn)Livin在正常膀胱組織無表達(dá)，而在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)率為85.2%，二者表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Livin的表達(dá)和膀胱移行細(xì)胞癌的病理分級(jí)、臨床分期、是否復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)(P>0.05)。Livin在BTCC中高表達(dá)，提示Livin可通過抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)BTCC的發(fā)生發(fā)展起重要作用;Livin在膀胱癌中有望成為一種有效、敏感的腫瘤標(biāo)志物，并為BTCC的基因治療提供新的方向。有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)非浸潤性膀胱癌患者的Livin、suivivin、Bclx及Bcl-2/BAX表達(dá)進(jìn)行測定，并觀察與復(fù)發(fā)的關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)Livin與非浸潤性膀胱癌的進(jìn)展有關(guān)，Livin與腫瘤的復(fù)發(fā)關(guān)系密切，可作為膀胱癌復(fù)發(fā)的早期監(jiān)測指標(biāo)[2]。

參考文獻(xiàn)

1Salvesen GS,Duckett CS.IAPproteins:Blocking the road to death’s door.Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3:401-410.

2Kasof GM,Gomes BC.Livin,anovel inbitor of apoptosis protein family member. J Biol Chem,2001,276: 3238-3246.

3Lin JH,dENG G,Huang Q,et al.KIAP, anovel member of the inhibitor of apoptosis protein family. Biochem Biophys Res Commun,2000,279:820-831.

4Kirch DG, Doseff A,Ghau BN, et al. Caspase-3 dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochromec.J Biol Chem,1999,274:21155-21161.

5Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.MLIAP,anovel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas.Curr Biol,2000,10:1359-1366.

6Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern. FEBS Lett,2001,495:56-60.

7Hariu H, Hirohashi Y, Tcrigce T,et al. Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family, Livin/ML-IAP in lung cancer.Clin Cancer Res,2005,11: 1000-1009.

8Vuvic D, Deshayes K,Ackerly H, et al. SMAC negatively regulates the anti2apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP).J Biol Chem,2002,277:12275-12279.

9Sanna MG,da Silva Correia J,Ducrey O,et al. IAP suppressionof apoptosis involves distinct mechanisms: The TAK1/JNK1 si-gnaling cascade and caspase inhibition.Mol Cell Biol,2002,22:1754-1766.

10Vucic D, Deshayes K, Ackerly H, et al. SMAC negatively regulates the antiapoptptic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP).J Biol Chem,2002,277:12275-12279.

11Ashhab Y，Allan A, Polliack A, et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene wish different biological proper ties and tissue distribution pattern. FEBS Lett,2001,495:56-60.

12Schmollinge JC,Vonderheide RH,Hoar KM, et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein (ML-IAP) is a target for immune-mediated tumor destruction. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:3398-3403.

13Tanabe H, Yagihashi A, Tsuji N，et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small-cell lung cancer. Lung Cancer,2004,46:299-304.

14孫建國，廖榮霞，陳正堂，等.一種新的凋亡抑制蛋白Livin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá).重慶醫(yī)學(xué)，2004，33:982-984.

15Ka H, Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas.Am J Pathol,2003,163:413-422.

16Gazzaniga P,Gtadilone A,Giuliani L,et al.Expression and prognostic significance of LIVIN, SURVIVIN and other apoptosis related genes in the progression of super ficial bladder cancer.Ann Oncol,2003,14:85-90.

17何遠(yuǎn)橋，曾甫清，鞠文.凋亡抑制因子Livin在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義.臨床泌尿外科雜志,2006，21：458-460.

(收稿日期：2015-09-09)

【中圖分類號(hào)】R 73

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)03-0935-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.046