馮 笑，楊 陽(yáng)，熊紅燕，范崇熙，狄守印，胡 偉，段維勛，梁洪亮，金振曉，俞世強(qiáng)

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SIRT1信號(hào)通路介導(dǎo)紫檀芪抗內(nèi)皮細(xì)胞抗缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

馮 笑，楊 陽(yáng)，熊紅燕，范崇熙，狄守印，胡 偉，段維勛，梁洪亮，金振曉，俞世強(qiáng)

［摘要］：目的 研究不同濃度紫檀芪(PTE)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法 HUVECs經(jīng)1 μM/L和2 μM/L的PTE處理后,接受模擬缺氧復(fù)氧(SIR)損傷(缺氧70 min,復(fù)氧4 h),采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,使用酶活性測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)的釋放量和超氧化物歧化酶(SOD)的水平,使用western blot法檢測(cè)SIRT1、Ac-FOXO1、Bax和Bcl-2的表達(dá)情況,使用SIRT1阻斷劑EX527觀(guān)察SIRT信號(hào)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用。結(jié)果 SIR處理可以抑制HUVECs活性,抑制SIRT1表達(dá),上調(diào)Ac-FOXO1表達(dá),下調(diào)Bcl-2/Bax比例(與Control組比較,P＜0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA含量上升,SOD水平下降(與Control組比較,P＜0.05)。1 μM/L和2 μM/L的PTE處理均可以發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,提高細(xì)胞活力,降低了MDA水平,提高了SOD水平(與SIR組比較,P＜0.05)。此外,PTE處理上調(diào)了SIRT1表達(dá),抑制了Ac-FOXO1表達(dá),并且提高Bcl-2/Bax比例(與SIR組比較,P＜0.05)。EX527處理后細(xì)胞活力下降,凋亡增加(與SIR＋PTE組比較,P＜0.05)。結(jié)論 PTE可以保護(hù)HUVECs抵抗缺血再灌注損傷,其機(jī)制是激活SIRT1/FOXO1保護(hù)性信號(hào)通路,抑制HUVECs凋亡。

［關(guān)鍵詞］：紫檀芪；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；缺血再灌注損傷；沉默信息調(diào)控因子1

Pterostilbene alleviates HUVECs ischemia reperfusion injury via activating SIRT1 and suppressing cell apoptosis

Feng Xiao,Yang-Yang,Xiong Hong-yan,Fan Chong-xi,Di Shou-yin,Hu Wei,Duan Wei-xun,Liang Hong-liang,Jin Zhen-xiao,Yu Shi-qiang
Department of Cardiovascular Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Shaan＇xi Xi＇an 710032,China
Corresponding author:Jin Zhen-xiao,Email:13571921011@ 163.com

［Abstract］：Objective To explore the effect of pterostilbene on simulated ischemia reperfusion(SIR) injury of HUVECs and the roles of SIRT1 in this process.Methods The cultured HUVECs,pretreated with PTE(1 or 2 μM/L) for 2h,were subjected to SIR.Then cell counting kit-8 was used to detect cell viability,and specialized kits were used to detect the concentration of malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) in the cell culture medium.The expression of Silent information regulator 1(SIRT1),Acetylated fork head transcription factor 1(Ac-FOXO1),Bcl-2 and Bax were quantified using western blotting.The specific inhibitor of SIRT1 EX527 was used to investigate the roles of SIRT1 in this process.Results SIR treatment reduced cell viability significantly(from 1.219±0.021 to 0.593±0.036),down-regulated SIRT1 expression,up-regulated Ac-FOXO1 expression and reduced the Bcl-2/Bax ratio(vs the control group,P＜0.05).Both 1μM/Land 2 μM/L PTE increased the cell viability(to 0.762±0.029和0.860±0.019),down-regulated the MDA level(to 14.16±1.62 and 11.23±1.35) and up-regulated the SOD level(to 64.16±3.97 and 86.06±5.48 )(vs the SIR group,P＜0.05).Western blot analysis showed that SIRT1 expression increased and Ac-FOXO1 expression decreased.The Bcl-2/Bax ratio was increased(vs the SIR group,P＜0.05).EX527 treatment reduced the cell viability(from 0.743±0.031 to 0.6140±0.025)(vs the SIR＋PTE group,P＜0.05).Conclusion PTE treatment may activate SIR injury through activating SIRT1-Ac-FOXO1 pathway and suppressing cell apoptosis.

［Key words］： Pterostilbene；HUVECs；Ischemia reperfusion injury；Silent information regulation 1

心血管疾病是當(dāng)今社會(huì)危害人類(lèi)生命健康的首要?dú)⑹?心肌缺血再灌注損傷是重要的損傷類(lèi)型,內(nèi)皮細(xì)胞損傷在這個(gè)病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了血管和周?chē)M織的屏障,心肌缺血再灌注損傷可以促使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,最終損傷向心肌重構(gòu)和心衰的方向發(fā)展[3-4]。因而,如何保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞成為減弱心肌缺血再灌注損傷的重要著眼點(diǎn)。

紫檀芪( pterostilbene,PTE)是廣泛存在于藍(lán)莓、黑莓等漿果中非黃酮類(lèi)多酚化合物,同白藜蘆醇互為同系衍生物,但其生物活性要較白藜蘆醇強(qiáng)[5]。紫檀芪可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗增殖等多種機(jī)制[1,5-8],對(duì)多種疾病具有治療或預(yù)防作用,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、退行性疾病以及腫瘤等[5-7]。值得注意的是它在心血管系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用[7],并且抵抗缺血再灌注過(guò)程中發(fā)生的氧化應(yīng)激損傷[6]。以往的研究表明紫檀芪可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和自噬,發(fā)揮一定的保護(hù)作用[9-11],但是它是否可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抵抗心肌缺血再灌注損傷尚未報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試劑 模擬缺氧復(fù)氧(simulated ischemia reperfusion,SIR)T1特異性阻斷劑EX527、脫氧葡萄糖、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、連二亞硫酸鈉均購(gòu)自Sigma公司。PTE購(gòu)自aladdin公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司。CCK-8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自七海生物公司。超氧化物岐化酶( SOD)檢測(cè)試劑盒和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。抗SIRT1抗體購(gòu)自CST公司,抗Ac-FOXO1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司,抗Bcl-2和抗Bax抗體購(gòu)自CST公司?？功?肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自CMCTAG公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備儀器廠(chǎng)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司。倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。細(xì)胞用低速離心機(jī)購(gòu)自Saitexiangyi公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板購(gòu)自Corning公司。Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及發(fā)光成像設(shè)備均購(gòu)自Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自SpectraMax公司。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的培養(yǎng)及SIR模型的建立 常規(guī)HUVEC細(xì)胞,臍靜脈內(nèi)皮SIR損傷通過(guò)模擬缺血液及氮?dú)猸h(huán)境實(shí)現(xiàn)。缺血液配方為NaCl 137 mM/L、KCl 12 mM/L、MgCl20.49 mM/L、CaCl2·2H2O 0.9 mM/L、HEPES 4 mM/L、脫氧葡萄糖10 mM/L、連二亞硫酸鈉0.75 mM/L、乳酸鈉20 mM/L,pH值調(diào)至6.5。加入缺血液的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶置于含95%N2和5%CO2的密閉容器中缺氧70 min(該容器密閉且持續(xù)通氣),更換正常DMEM后在含95%O2和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧孵育4 h。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及CCK-8法細(xì)檢測(cè)各組HUVEC細(xì)胞活力 首先,本實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為對(duì)照組、SIR組、PTE 1 μM/L＋SIR組、PTE 2 μM/L＋SIR 組,每組10個(gè)復(fù)孔,PTE預(yù)處理時(shí)間為4 h。隨后,PTE(2 μM/L)處理前用SIRT1阻斷劑EX527預(yù)處理2 h阻斷SIRT1,EX527濃度為10 μM/L(已證實(shí)該濃度本身對(duì)SIR后細(xì)胞活力無(wú)影響),將細(xì)胞分組為SIR組、PTE＋SIR組、PTE＋EX527＋SIR組、EX527＋SIR組,觀(guān)察EX527對(duì)PTE抗HUVEC細(xì)胞SIR損傷的影響。各組處理后將培養(yǎng)液棄掉,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞培養(yǎng)板3次,再加入100 μl DMEM培養(yǎng)液和10 μl CCK-8檢測(cè)液,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(450 nm波長(zhǎng)下吸光度值),本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量及SOD活力含量檢測(cè) 各組處理結(jié)束后,取培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA及SOD含量。每組重復(fù)3次。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞SIRT1通路及凋亡指標(biāo)水平變化 各組細(xì)胞處理結(jié)束后,用PBS清洗后置于冰上,用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞,用添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液于冰上裂解20min,隨后以12000r/min離心20min。收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物,采用二辛可寧酸BCA法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整其至一致。取30 μg總蛋白,加入相應(yīng)體積的5×上樣緩沖液,煮沸7 min。將該樣品用于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC膜)上。NC膜用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉4 h后分別孵育在SIRT1(1∶5 000)、Ac-FOXO1(1∶500)、Bax、Bcl-2和β-actin(1∶1 000)中,4℃孵育過(guò)夜。然后用TBST洗滌并于常溫用1∶5 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或鼠IgG孵育2 h。然后用TBST洗滌,最后在Bio-Rad照相系統(tǒng)采集照片,并用Image Lab軟件對(duì)其進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件包分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞活力的影響如表1和圖1所示,SIR處理顯著降低了HUVEC細(xì)胞活力(與對(duì)照組相比,P＜0.05),梯度濃度PTE預(yù)處理顯著提高了細(xì)胞活力(與SIR組相比,P＜0.05),其中2 μM/L的PTE保護(hù)效果更為明顯。倒置顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)SIR組細(xì)胞受損皺縮,大量細(xì)胞死亡。PTE預(yù)處理后細(xì)胞死亡減少,細(xì)胞形態(tài)顯著改善。

表1　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞活力的影響(n＝10,±s)

表1　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞活力的影響(n＝10,±s)

注：a與對(duì)照組比較P＜0.05；b與SIR組比較P＜0.05；c與PTE1 μM/L＋SIR組相比P＜0.05。

組別　OD值對(duì)照組　1.219±0.021 SIR組　0.593±0.036aPTE 1μM/L＋SIR組　0.762±0.029bPTE 2 μM/L＋SIR組　0.860±0.019bc

2.2 PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響 如表2所示,缺血再灌注損傷后HUVEC釋放的MDA顯著上升,而SOD的活性顯著下降(與對(duì)照組相比,P＜0.05)。給予PTE預(yù)處理后,一定程度上減少了MDA釋放,提高了SOD活性(與SIR組相比,P＜0.05)。且該作用呈一定的劑量依賴(lài)性(與PTE 1μM/L＋SIR相比,P＜0.05)。

表2　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響(n＝6,±s)

表2　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響(n＝6,±s)

注：a與對(duì)照組比較P＜0.05；b與SIR組比較P＜0.05；c與PTE1 μM/L＋SIR組相比P＜0.05。

組別　MDA(μM/L)　 SOD(U/L)對(duì)照組　3.12±0.58　 120.59±6.28 SIR組　18.63±2.07a　40.25±3.75aPTE 1μM/L＋SIR組　14.16±1.62b　64.16±3.97bPTE 2 μM/L＋SIR組　11.23±1.35bc　86.06±5.48bc

圖1　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞形態(tài)的影響(倒置顯微鏡,200倍)

2.3 PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞SIRT1和Ac-FOXO1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖2所示為各組Western blot典型結(jié)果,并用圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？梢?jiàn):與對(duì)照組相比,SIR處理顯著降低了SIRT1的表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)了Ac-FOXO-1的表達(dá)( P＜0.05)；降低了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),上調(diào)了凋亡蛋白Bax表達(dá)( P＜0.05)。與SIR組相比,PTE預(yù)處理顯著提高了SIRT1表達(dá),同時(shí)下調(diào)了Ac-FOXO1表達(dá)( P＜0.05)；增加了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),下調(diào)了凋亡蛋白Bax表達(dá)( P＜0.05)。該作用有劑量依賴(lài)性,2 μM/L PTE保護(hù)效果更為明顯( P＜0.05)。

2.4 PTE與EX527共處理對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞的影響 前期結(jié)果顯示2 μM/L的PTE具有較好的保護(hù)效果,給予SIRT1阻斷劑后檢測(cè)細(xì)胞活力值發(fā)現(xiàn),與PTE＋SIR組相比,PTE＋SIR＋EX527組細(xì)胞活力顯著下降( P＜0.05)。與SIR組相比,EX527 ＋SIR組對(duì)HUVEC細(xì)胞活力沒(méi)有影響( P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3　PTE與EX527共處理對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞活力的影響(n＝10,±s)

表3　PTE與EX527共處理對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞活力的影響(n＝10,±s)

注：a與SIR比較P＜0.05；b與PTE＋SIR組比較P＜0.05；c與PTE＋SIR＋EX527組比較P＜0.05。

組別　OD值SIR組　0.502±0.042 PTE＋SIR組　0.743±0.031aPTE＋SIR＋EX527組　0.6140±0.025bEX527＋SIR組　0.490±0.056c

圖2　PTE對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl-2、Bax等蛋白表達(dá)的影響

2.5 PTE與EX527共處理對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞的影響 圖3所示為各組Western blot典型結(jié)果,并用圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？梢?jiàn):與SIR組相比,PTE＋SIR處理組SIRT1的表達(dá)水平顯著增加,同時(shí)Ac-FOXO-1的表達(dá)顯著下降( P＜0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增加,凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯下降( P＜0.05)。與PTE＋SIR組相比,PTE＋SIR＋EX527組SIRT1表達(dá)輕微下降,Ac-FOXO1表達(dá)顯著增加( P＜0.05)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降,凋亡蛋白Bax表達(dá)增加( P＜0.05)。與SIR組相比,EX527＋SIR組未引起各蛋白表達(dá)顯著變化。

圖3　PTE與EX527共處理對(duì)SIR損傷后HUVEC細(xì)胞SIRT1、Ac-FOXO1、Bcl-2、Bax等蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

紫檀芪可以通過(guò)多種作用機(jī)制,可以保護(hù)多種組織細(xì)胞,對(duì)多種疾病具有治療和預(yù)防作用[5,8]。以前的研究顯示紫檀芪可以劑量依賴(lài)性的促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS磷酸化,增強(qiáng)NO合成,最終可以阻止內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[10]。對(duì)于氧化修飾的低密度脂蛋白所誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,紫檀芪同樣可以發(fā)揮保護(hù)作用,機(jī)制涉及其抗氧化應(yīng)激功能[9],該課題組的另一項(xiàng)研究顯示紫檀芪可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬,最終避免凋亡的命運(yùn)[9]。上述證據(jù)都支持紫檀芪可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能,抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)于心血管疾病具有預(yù)防和治療作用。筆者的研究在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注模型上探討了紫檀芪的保護(hù)作用,最終發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的保護(hù)效果。結(jié)果提示缺血再灌注處理的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng),凋亡指數(shù)明顯增加,這些效果可以被紫檀芪抑制。

Sirtuins是一個(gè)高度保守的家族,包含7個(gè)NAD＋依賴(lài)的脫乙?；?Sirt1是一種位于細(xì)胞核的脫乙酰化酶[12-13]。Sirt1可以作用于其下游的多種底物發(fā)揮生理效應(yīng),叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(fork head transcription factor 1,FOXO1)是其中重要的一種[14-15]。SIRT1可以作用于FOXO1,通過(guò)去乙酰化作用激活FOXO1。以前的研究證明SIRT1/FOXO1信號(hào)通路在心臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[15]。并且該信號(hào)通路同Bax和Bcl-2凋亡信號(hào)通路密切相關(guān)[16-17],它可以增加Bcl-2/Bax比例,最終抑制凋亡的發(fā)生[16]。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注處理后Sirt1下調(diào),乙?；疐OXO1上調(diào),Bcl-2/Bax比例下調(diào),凋亡增加。紫檀芪處理后可以抑制這些效應(yīng)的發(fā)生,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,并且這種保護(hù)作用表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性。紫檀芪的保護(hù)效應(yīng)可以被Sirt1阻斷劑抵消,進(jìn)一步肯定了SIRT1/FOXO1凋亡信號(hào)通路參與紫檀芪對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上,筆者發(fā)現(xiàn)紫檀芪可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抵抗缺血再灌注損傷,其機(jī)制是激活SIRT1/FOXO1保護(hù)性信號(hào)通路,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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(修訂日期:2015-11-04)

(收稿日期:2015-10-20)

通訊作者：金振曉,E-mail:13571921011@ 163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81570231,81570230,81570232,81470415,81270170,81200151,81470411)；陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(2015KW-047)；陜西省社會(huì)發(fā)展公關(guān)計(jì)劃(2015SF104,2012K15-02-01)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTCL03-01)；陜西省自然科學(xué)基金( 2014JM4106 )；西京醫(yī)院學(xué)科助推計(jì)劃( XJZT14203,XJGX12C11,XJGX13LC15)

DOI:10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2016.01.13

作者單位：710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科(馮 笑、段維勛、梁洪亮、金振曉、俞世強(qiáng))；710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)系(楊 陽(yáng))；710003陜西西安,西安市中心醫(yī)院胸心外科；710038陜西西安,第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科(范崇熙、狄守印)；710032陜西西安,第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系(胡 偉)