鞠志海，王 晨，馬金輝，于 潔，喬葉薷，黑飛龍

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iPSC外泌體載體肺血管內(nèi)皮細胞及肺泡Ⅱ型上皮細胞攝入研究

鞠志海，王 晨，馬金輝，于 潔，喬葉薷，黑飛龍

［摘要］：目的 全身炎癥反應在體外循環(huán)致肺損傷過程中起關鍵作用。外泌體載體能否被肺臟靶細胞有效攝入是急性肺損傷(ALI)基因治療的關鍵。方法 超速離心法提取體外培養(yǎng)的iPS細胞外泌體,Western Blot鑒定其特征蛋白表達。PKH26標記的外泌體與肺微血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞體外共培養(yǎng),免疫熒光共聚焦技術檢測靶細胞對外泌體的吸收、攝取情況。結果 iPS細胞來源的外泌體可以被肺微血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞有效攝入。結論 iPS細胞外泌體可以被肺臟靶細胞有效攝入,是ALI基因治療的理想載體。

［關鍵詞］：急性肺損傷；iPS細胞；外泌體；載體；攝入

Study on uptake of exosomes derived from iPSC in pulmonary microvascular endothelial cells and typeⅡalveolar epithelial cells

Ju Zhi-hai,Wang Chen,Ma Jin-hui,Yu Jie,Qiao Ye-ru,Hei Fei-long
Department of Cardiopulmonary Bypass,Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,National Center for Cardiovascular Diseases,Beijing 100037,China
Corresponding author:Hei Fei-long,Email:heifeilong@ 126.com

［Abstract］：Objective Systemic inflammatory response plays a vital role in lung injury caused by CPB.The success of gene therapy toward to ALI is mainly depended on whether an exosome vehicles could be absorbed by the target cells in lung.Methods Exosomes were isolated from iPS cells(iPS-Exo) derived from renal tubular epithelial cells using ultracentrifugation and characterized by western blotting and then labeled with PKH26 and cocultured with pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs) or typeⅡalveolar epithelial cells(A549),Using laser scanning confocal microscopy to decide the uptake of these exosomes.Results iPS-Exo could be absorbed by both PMVECs and A549 in vitro.Conclusion The iPS-Exo may be considered as an ideal carrier since they could be delivered to the target cells in lung successfully.

［Key words］： Acute lung injury；iPS cell；Exosomes；Carrier；Uptake

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)手術期間,肺是受損最為常見和損傷嚴重的器官之一,重者可表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury,ALI)[1]。肺損傷機制目前尚未明了,學者研究認為全身炎癥反應在CPB肺損傷過程中發(fā)揮重要作用[2],特別是NLRP3(nucleotide-binding-domain,leucine-rich repeat domain containing protein 3,NLRP3)炎性小體對ALI炎性調(diào)控作用十分關鍵[3-4]。siRNA( small interfering RNA)沉默NLRP3炎性小體可有效控制炎癥反應,減輕組織損傷[5]。iPS細胞外泌體(exosomes)是非常理想的siRNA載體,其能否被肺臟的靶細胞高效吸收和攝取成為ALI精準基因治療的關鍵。

1 試劑與方法

1.1 主要試劑 iPS細胞由本課題組前期研究獲得[6],肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549購自ATCC),PSCeasy多潛能干細胞培養(yǎng)基(賽貝生物),肺微血管內(nèi)皮細胞及ECM培養(yǎng)基(Sciencell),PKH26(Mini 26,Sigma),Phalloidin-FITC(P5282,Sigma),FITCWGA(ab20528,Abcam),抗CD63抗體(ab59479,Abcam),抗TSG101抗體(ab83,Abcam)。

1.2 材料與設備 超速離心管(Beckman)、Optima L-100XP超速離心機(Beckman)、Leica SP8激光掃描共聚焦顯微鏡(Germany)。

1.3 實驗方法

1.3.1 iPS細胞培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基收集 將iPS細胞復蘇至Matrigel包被過的培養(yǎng)皿中,37oC、5%CO2孵箱孵育,定時換液,待細胞匯合度達70%時棄舊培養(yǎng)基加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,收集細胞培養(yǎng)上清,1 000 g離心10 min,取上清備用。

1.3.2 iPS細胞外泌體提取 將上清以300 g,10 min離心一次；2000 g,10 min一次；10 000 g,30min一次；100 000 g,70 min,棄上清。PBS洗滌,100 000 g離心70 min,所得外泌體以100 μl PBS重懸-80oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 外泌體PKH26染色 100 μl外泌體懸液加入PKH26染色工作液,吹打混勻,室溫孵育5 min,不時搖勻,血清終止染色,室溫固定1 min,加PBS至終體積7 ml,配平后120 000 g離心70 min,棄上清使管中剩余100 μl液體中重新加PBS至7 ml,120 000 g離心70 min,棄上清,500 μl完全培養(yǎng)基重懸外泌體,向培養(yǎng)有微血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞的3.5 cm共聚焦培養(yǎng)皿中各加入100 μl外泌體,37oC、5%CO2孵箱孵育4 h。

1.3.4 免疫熒光 吸走細胞培養(yǎng)基,PBS洗滌兩次,4%PFA室溫固定。PBS洗滌一次,0.1%Triton通透工作液室溫通透10 min。吸走Triton通透工作液,5%BSA室溫封閉60 min。加一抗,2～8oC孵育過夜。PBS洗滌后,DAPI封片染核,室溫避光孵育5 min,激光共聚焦顯微鏡下觀察成像。

1.3.5 Western Blot 恒壓120 V電泳90 min；轉膜；封閉；加一抗:抗CD63(1∶1 000)或抗TSG101(1∶1 000),4℃搖床過夜；TBST洗膜；加二抗室溫孵育1 h；TBST洗膜；顯色。

2 結 果

2.1 iPS細胞多能性標記物鑒定 iPS細胞標志物染色顯示見圖1。

2.2 iPS細胞外泌體特征蛋白表達情況 外泌體特征蛋白表達見圖2。

2.3 肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVECs）攝入iPS外泌體

圖3的左側圖顯示正常狀態(tài)下PMVECs呈典型的鋪路石樣排列；右側圖顯示PMVECs可以有效的攝入iPS外泌體。

2.4 肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549）攝入iPS外泌體圖4顯示PKH26標記的iPS細胞外泌體可以被A549細胞有效攝入。

圖1　上列自左向右依次為:Oct4、Sox2、TRA-1-60下列自左至右依次為:SSEA4、TRA-1-81、Nanog

圖2　Western Blot結果顯示外泌體特征蛋白TSG101(46 kDa)、CD63(26 kDa)

圖3　PMVECs(左)；免疫熒光(右),藍色:DAPI染核；綠色:WGA標記胞漿；紅色:PKH26標記外泌體

圖4　肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549)免疫熒光,DAPI染核為藍色；Phalloidin標記細胞actin為綠色；PKH26標記外泌體為紅色

3 討 論

CPB手術期間,肺是最常見的受損器官之一,研究認為全身炎癥反應在CPB肺損傷過程中發(fā)揮重要作用。特別是炎癥反應的質(zhì)量失衡在ALI的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用[7]。CPB應激刺激、缺血-再灌注損傷等因素通過非特異性免疫模式識別受體激活NLRP3/ASC/Pro-caspase-1炎性復合體,Caspase-1水解、切割IL-1β和IL-18前體,使其轉化為有活性的成熟體。一方面增加肺血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞的通透性；另一方面促進更多炎性細胞因子產(chǎn)生釋放,引發(fā)炎性級聯(lián)反應進一步加重肺損傷[7,8]。

雖然ALI相關的病理生理機制目前已經(jīng)較為清楚,但仍缺乏有效的治療措施,目前的治療手段均存在一定的缺陷。長時間機械通氣可加重肺損傷；液體限制則可能導致不同程度的腎損傷；皮質(zhì)激素可產(chǎn)生神經(jīng)肌病[9]。如能采用基因治療手段對炎性反應調(diào)控通路的上游環(huán)節(jié)進行干預,則可有效的控制炎癥反應發(fā)生的程度和規(guī)模,使CPB引致的肺損傷得到有效控制。

NLRP3炎性小體在炎癥反應調(diào)控中發(fā)揮十分關鍵的作用。siRNA等藥物沉默或抑制NLRP3炎性小體可有效控制炎癥反應,減輕組織損傷[5,10-11]。外泌體是生物體內(nèi)的一種納米級囊泡結構,作為納米級藥物載體被廣泛研究[12-15],而獲取組織相容性好、無免疫原性的外泌體是遞送siRNA的關鍵。iPSc不存在倫理問題,細胞擴增容易,無免疫排斥,可大量獲取,是十分理想的外泌體供體細胞類型,但其能否被肺臟靶細胞高效吸收和攝取成為ALI基因治療的關鍵。

血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞是構成肺泡氣血屏障的兩種主要細胞,是siRNA作用的關鍵靶細胞。抑制肺組織的炎癥反應,減輕肺損傷可以維持肺泡氣血屏障的正常功能,緩解ALI。本研究采用Thery等[17]報道的標準外泌體提取流程從iPS細胞培養(yǎng)基中分離、提取的外泌體均能表達外泌體特征蛋白CD63和TSG101,說明從iPS細胞獲取外泌體是可行的。iPS細胞可以體外大量增殖,這就為外泌體的大量獲取提供了保證,也為下一步siRNA的裝載做好了準備。外泌體能否穿梭進入肺臟的靶細胞是siRNA基因治療的另一關鍵。本研究采用免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦技術檢測顯示PKH26標記的外泌體均可在血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞出現(xiàn),說明從iPS細胞獲取的外泌體可以被這兩種細胞有效吸收、攝取。另外,外泌體的膜性結構能夠通過膜蛋白與靶細胞膜融合,極大地避免細胞吞噬-溶酶體途徑帶來的藥物降解、細胞毒性和免疫原性等問題。

本研究提示iPS細胞外泌體可作為理想的天然載體,通過裝載siRNA藥物進入靶細胞,沉默或抑制NLRP3炎性小體來調(diào)控肺組織的炎癥反應,減輕肺損傷,探索ALI基因治療的新方法。

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(修訂日期:2016-02-24)

(收稿日期:2016-02-24)

通訊作者：黑飛龍,E-mail:heifeilong@ 126.com

基金項目：國家自然科學基金面上項目(31370993)；北京協(xié)和醫(yī)學院研究生創(chuàng)新基金(2015E-CX03)

DOI:10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2016.01.12

作者單位：100037北京,北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院國家心血管病中心阜外醫(yī)院體外循環(huán)中心