宗萬里， 魯　剛

(威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所， 山東 威?！?64209)

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基于液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法的魚肉中氯霉素殘留量測定

宗萬里， 魯剛

(威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所， 山東 威海264209)

摘要：建立了魚肉中氯霉素殘留量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法.樣品用甲醇直接提取后，經(jīng)C(18)固相萃取小柱凈化后，注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中進行檢測.利用ESI源(負(fù)離子模式)，C(18)液相色譜柱，以及SRM方法對樣品中的氯霉素進行定性、定量分析.實驗結(jié)果表明：方法測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%(n=6),平均回收率大于90%,線性范圍為1～10 ng/mL ,最低檢出限為0.029 ng/mL.

關(guān)鍵詞：液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜；魚肉；氯霉素

0引言

氯霉素屬于廣譜類抗生素，曾被廣泛應(yīng)用于動物細菌性疾病的臨床治療.然而，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，氯霉素具有較強的副作用，對人類健康會產(chǎn)生諸多不良影響，如果長期微量攝入含有氯霉素殘留的食物，不僅能使大腸桿菌、沙門氏菌等菌株產(chǎn)生耐藥性， 而且還會造成機體正常菌群失調(diào)，從而感染各種疾病.因此，對水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的監(jiān)控與檢測就顯得十分重要.目前，測定食品中氯霉素殘留量常用的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[1-5].本研究使用甲醇提取魚肉中氯霉素殘留量，再經(jīng)C18固相萃取小柱凈化后，直接注入液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析檢測，取得了較好的效果，本方法與使用乙酸乙酯提取方法相比，無需去除魚肉中的脂肪，是一種較為快速的測定魚肉中氯霉素殘留量的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法.

1材料與方法

1.1試劑與儀器

1)實驗所用試劑包括：甲醇，色譜純，TEDIA公司；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，98.5%,0.25 g/瓶,Dr.Ehrenstorfer GmbH；實驗用水為娃哈哈純凈水，1.25 L/瓶.

2)實驗所用儀器包括：C18固相萃取小柱，500 mg,6 mL,ANPEL Scientific Instrument(Shanghai) Co.，Ltd.；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，Thermo TSQ QUANTUM ULTRA三重四極桿質(zhì)譜檢測器(配電噴霧離子源ESI)；Hypersil Gold型反相液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),Thermo fisher公司；0.22μm有機相針管濾頭,Agela公司;MS3 Digital型漩渦振蕩器，IKA公司；樣品粉碎機，九陽股份有限公司；Neofuhe23R型臺式高速冷凍離心機，上海力申科學(xué)儀器有限公司.

1.2實驗條件

1.2.1液相色譜條件.

實驗的色譜條件為：色譜柱，C18柱，100×2.1 mm(i,d),3 μm；流動相，甲醇(A相)、水(B相).梯度條件為：0～0.5 min，10% A；0.5～6.5 min，線性增至90% A，保持2.5 min；9.0～9.5 min線性減至10% A，保持3.5 min；流速0.2 mL/min.

1.2.2質(zhì)譜參考條件.

1)電離方式：采用電噴霧電離，負(fù)離子模式；噴霧電壓為3 000 kV；鞘氣(N2)壓力為30(arbitrary units)；輔助氣(N2)流量為10(arbitrary units)；碰撞室(氬氣)壓力為1.5 m Torr.

3)掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(Selective Reaction Montoring,SRM)方式；母離子：320.9，子離子：152.1(定量離子，碰撞能量22 eV)、121.2(碰撞能量17 eV)、176.1(碰撞能量39 eV)；質(zhì)譜divert valve狀態(tài)：0～8.0 min處于waste狀態(tài)，8～10 min處于load狀態(tài)，10～13 min處于waste狀態(tài).

1.3溶液配制與樣品處理

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與處理.

準(zhǔn)確稱取50 mg的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 000 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液.準(zhǔn)確吸取0.1 mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液.再從1 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別吸取0.02、0.04、0.08、0.16、0.20 mL分別加入到5個各加入5 g含氯霉素空白魚肉樣品的容量為50 mL帶有刻度的離心管中，用甲醇溶液定容至20 mL，旋渦混合器提取2 min，在高速離心機上以8 000 r/min離心5 min，之后吸取上清液2 mL過柱凈化，得1、2、4、8、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液.每個濃度溶液經(jīng)0.22 μm針管有機濾膜過濾后，取10 μL注入高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析.

1.3.2樣品前處理.

1)樣品的處理.稱取5.0 g(精確至0.01 g)粉碎后的樣品于50 mL具塞刻度管中,試樣用甲醇定容至10 mL,搖勻后于旋渦混合器提取2 min，在高速離心機上以8 000 r/min離心5 min，之后吸取上清液2 mL過柱凈化.

2)凈化.取C18固相萃取小柱，先后加入1柱管體積甲醇，1柱管體積水對小柱活化，加入2 mL樣品處理液緊接著再加入1柱管體積水洗脫雜質(zhì)，最后用甲醇洗脫定容至2 mL.

2結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

本研究使用空白基質(zhì)加標(biāo)后的樣品處理液作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，與直接使用溶劑來配置相比，能夠降低回收率的影響，同時能夠校正在離子源處樣品基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng).

2.2樣品前處理

由于氯霉素易溶于甲醇等有機溶劑，本研究采用甲醇直接浸泡魚肉提取其中氯霉素的殘留量，魚肉樣品經(jīng)過甲醇提取后，再經(jīng)過C18固相萃取小柱除去提取液中可能溶有的蛋白質(zhì)、脂肪以及極性雜質(zhì)，以減小蛋白質(zhì)在液相色譜柱上的不可逆吸附，在保護色譜柱的同時能夠減少對質(zhì)譜檢測器的離子源污染.

2.3色譜及質(zhì)譜條件

本研究采用反相色譜柱C18(100 mm×2.1 mm,3 μm),在梯度洗脫的條件下對氯霉素進行分離，氯霉素的出峰時間為9 min左右，可見氯霉素在反相柱上有較強的保留，氯霉素峰型尖銳，流動相的條件合適.在質(zhì)譜檢測器方面，利用質(zhì)譜檢測器自身的方法優(yōu)化功能，選出母離子320.9的3個豐度最強的子離子，其中1個豐度最強的子離子設(shè)為定量離子，其余2個設(shè)為定性參考離子，然后優(yōu)化出3個子離子的最佳碰撞能量.由于氯霉素在9 min出峰，在質(zhì)譜檢測器端使用切換閥，將流動相在8～10 min切進離子源，其他時間將流動相切出質(zhì)譜檢測器，使流動相不經(jīng)過離子源，以減少離子源的污染.

2.4色譜圖

在“1.2”項的色譜及質(zhì)譜條件下,得到氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品在SRM方式下的總離子流圖、SRM質(zhì)譜圖、空白樣品的總離子流圖、加標(biāo)空白樣品的總離子流圖，具體如圖1～4所示.由圖可見，加標(biāo)樣品譜圖干凈，氯霉素出峰良好，無干擾.在本研究色譜條件下，實驗結(jié)果良好.

圖1氯霉素標(biāo)樣SRM方式下的總離子流圖

圖2氯霉素標(biāo)樣SRM方式下的質(zhì)譜圖

圖3　樣品SRM方式下的TIC色譜圖

圖4加標(biāo)樣品SRM方式下的TIC色譜圖

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢出限

在本實驗條件下，以峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程，以基線噪聲3倍峰面積對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(S/N=3)，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1.

表1　回歸方程的基本參數(shù)

2.6精密度和加標(biāo)回收實驗

取不含氯霉素的鮮魚肉樣品進行加標(biāo)回收實驗，向5g樣品中分別添加1 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.02、0.05、0.1 mL，即樣品中氯霉素含量為分別為4、10、20 μg/kg.按前述樣品處理方法進行樣品處理，重復(fù)6次.按“1.2”項及“1.3”項色譜、質(zhì)譜條件及處理方法進行測定，精密度和回收率計算結(jié)果見表2.

由表2可知，采用本方法所得實驗結(jié)果滿足檢測要求.

表2　樣品精密度和加標(biāo)回收實驗

3結(jié)論

通過實驗建立了魚肉中氯霉素殘留量測定的液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法前處理簡單快速.由于使用固相萃取柱對樣品處理液進行了凈化，能保護色譜柱并降低樣品處理液對離子源的干擾.同時，本方法的精密度與回收率均能滿足要求，可為水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的檢驗與監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)支持.

參考文獻:

[1]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.SC/T 3018-2004水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測定——氣相色譜法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部958號公告-13-2007水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測定——氣相色譜法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2007.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部781號公告-1-2006動物源食品中氯霉素殘留量的測定——氣相色譜—質(zhì)譜法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[4]賈宏新,鄒淼,林盛.超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定河蟹中氯霉素類藥物殘留量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013,23(13):2726-2729.

[5]薄爾琳，鄭懷東，劉學(xué)光，等.同位素稀釋液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定海參中氯霉素[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2013,3(4):36-41.

Determination of Chloramphenicol Residue in Fish Meat by LC-MS/MS

ZONGWanli，LUGang

(Weihai Supervision and Inspection Institute of Product Quality, Weihai 264209, China)

Abstract:A method for determination of Chloramphenicol residue in fish meat by liquid chromatography-Tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) is established．The sample is injected into LC-MS after being extracted by methanol and cleaned by the C(18) SPE tubes.The quantitative and qualitative analysis is done by ESI source under negative ion mode,C(18) liquid chromatography column and SRM.The experimental results show that the RSD of the method is less than 6%(n=6),the average recovery is more than 90%,the liner range is 1～10 ng/mL and the low detection limit is 0.029 ng/mL.

Key words：LC-MS/MS;fish meat;chloramphenicol;residue

中圖分類號：O657.63；TS254.7

文獻標(biāo)志碼：A

作者簡介：宗萬里(1981 — )， 男， 工程師， 從事食品成分檢測技術(shù)研究.

收稿日期：2015-10-26.

文章編號：1004-5422(2016)01-0027-03