趙淑芹　仇雪梅　丁　晨　王　磊　黃淑娟　馬兆文

(棗莊市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，山東 棗莊　277100)

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三種冷凍方法對(duì)人卵巢組織卵泡形態(tài)和凋亡的影響*

趙淑芹仇雪梅丁晨王磊黃淑娟馬兆文

(棗莊市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，山東 棗莊277100)

摘要：目的探討兩步法冷凍、玻璃化冷凍和程序化冷凍法凍融人類(lèi)卵巢組織的冷凍效果，以期探索更優(yōu)的卵巢組織冷凍方案。方法收集6例人卵巢組織，每例修剪成4塊，分別隨機(jī)分配到兩步法冷凍組(A組)、 玻璃化冷凍組(B組)、程序化冷凍組(C組)和新鮮對(duì)照組(D組)，組織學(xué)分析4組卵泡形態(tài)學(xué)變化，并通過(guò)TUNEL法評(píng)估卵泡的凋亡情況。結(jié)果兩步法冷凍組始基卵泡和初級(jí)卵泡的異常形態(tài)卵泡率比玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。玻璃化冷凍組始基卵泡異常形態(tài)率低于程序化冷凍組(P<0.05)，初級(jí)卵泡異常形態(tài)率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各冷凍組卵巢皮質(zhì)中始基卵泡的凋亡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢間質(zhì)細(xì)胞中，兩步法冷凍組間質(zhì)細(xì)胞凋亡率較玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，玻璃化冷凍組和程序化冷凍組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論人體卵巢組織凍融后大部分卵泡形態(tài)保持正常，兩步法凍存效果優(yōu)于玻璃化冷凍法和程序化冷凍。

關(guān)鍵詞：卵巢組織；玻璃化冷凍；兩步法冷凍；程序化冷凍；人

卵巢組織的冷凍保存為腫瘤患者，或患有卵巢早衰等其他疾病的患者提供了保存自身生殖內(nèi)分泌功能及生育能力的可能性。冷凍復(fù)蘇后的卵巢可進(jìn)行體外培養(yǎng)，自體移植，或使用輔助生殖技術(shù)來(lái)幫助不孕的女性。但卵巢組織的凍存策略現(xiàn)都處于探索階段中，至今還未形成規(guī)范的凍存策略。

在冷凍保存技術(shù)中，最常用的兩種冷凍方法為玻璃化冷凍法與程序化冷凍法。程序化冷凍法最早使用開(kāi)始于l996年，Hovatta與Newton等首次使用此法冷凍人類(lèi)卵巢組織[1-2]。而玻璃化冷凍卵巢組織則是最近二十年來(lái)的新興研究方向。并且現(xiàn)在部分文獻(xiàn)報(bào)道，玻璃化冷凍技術(shù)優(yōu)于程序化冷凍[3]。但是哪一個(gè)冷凍方案更適合凍融卵巢，并沒(méi)有統(tǒng)一定論。因此如何選擇冷凍卵巢組織的最佳方案一直是大家討論研究的熱點(diǎn)。

兩步法冷凍是簡(jiǎn)化的程序化冷凍，曾應(yīng)用于冷凍心臟瓣膜及血管，尚未應(yīng)用于冷凍卵巢組織。兩步冷凍法的主要優(yōu)點(diǎn)是將繁瑣的慢速冷凍過(guò)程簡(jiǎn)化，不僅保留了慢速降溫所需的基本條件，還降低了冷凍成本。本實(shí)驗(yàn)采用兩步冷凍法、玻璃化冷凍法和程序化冷凍法凍存人卵巢組織，通過(guò)研究三種冷凍方法對(duì)卵巢組織中卵泡的影響探索合適的冷凍卵巢組織策略，并凍融卵巢組織，為下一步卵巢組織移植奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料收集2012年至2013年山東省棗莊市婦幼保健院婦產(chǎn)科6例患者的卵巢組織，均為卵巢良性腫瘤?；颊呤中g(shù)時(shí)間為月經(jīng)干凈2～5 d期間，取材的卵巢組織術(shù)后病理證實(shí)處于卵泡期。所有患者均月經(jīng)規(guī)律，且近1年內(nèi)無(wú)激素服用史，術(shù)前內(nèi)分泌6項(xiàng)激素測(cè)定均在正常值范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)棗莊市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本提供者均簽署知情同意書(shū)。

1.2分組取非卵巢疾病患者切除的卵巢，用剪刀將卵巢組織與周?chē)Y(jié)締組織分離，被剪下的卵巢組織放入盛有10 ml PBS的無(wú)菌離心管中置于冰上，立即送至實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作臺(tái)中操作。用眼科剪在培養(yǎng)皿中將卵巢組織的髓質(zhì)分離。在實(shí)體顯微鏡下將卵巢皮質(zhì)切成約2 mm左右厚，面積約1.5 cm2大小的組織塊4塊，分別為兩步法冷凍組(A組)、玻璃化冷凍組(B組)、程序化冷凍組(C組)和新鮮對(duì)照組(D組)，即同一患者的卵巢組織按上述方法分為4塊并隨機(jī)分配到4組中。D組組織用4%多聚甲醛固定作組織學(xué)分析，A、B、C組冷凍保存。所有操作在室溫下1h內(nèi)完成。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑冷凍液：DMSO、乙二醇(EG)，購(gòu)自Sigma公司；聚乙二醇(PEG)、牛血清清蛋白(BSA)、蔗糖，購(gòu)自北京Solarbio公司。培養(yǎng)液：a-MEM液(Gibco公司)、10%胎牛血清(FBS，Gibco公司)、1%胰島素鐵硒傳遞蛋白等。

1.4組織冷凍與復(fù)蘇

1.4.1兩步冷凍法冷凍及復(fù)蘇步驟參考Liu等[4]凍存間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。將卵巢組織浸入冷凍液(10%DMSO+10%EG+6%PEG+0.5%BSA+0.5 mol/L蔗糖)，4℃10 min后直接放入盛有1 ml冷凍液的2.5 ml凍存管中放入-86℃超低溫冰箱(海爾DW-86L728)以1.0℃/min降溫至-80℃過(guò)夜，第2天投入液氮罐。復(fù)蘇A組組織時(shí)，放入37%水浴1 min后，將凍存管內(nèi)組織直接浸入10 ml PBS中5 min，再用培養(yǎng)液沖洗3遍。

1.4.2玻璃化冷凍法冷凍液與解凍液配方參照Moniruzzaman等[5]的冷凍配方，為了減少冷凍液的毒性及阻斷冰晶的形成，增添大分子冷凍保護(hù)劑(PEG6000)和動(dòng)物源性蛋白[6-7]。平衡液(ES)為7.5%DMS0+7.5%EG+6%PEG+0.5%BSA+0.5 mol/L蔗糖；冷凍液(VS)為15%DMSO+15%EG+6%PEG+0.2%BSA+0.5mol/L蔗糖。解凍液配方：(1)0.5 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培養(yǎng)基；(2)0.25 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培養(yǎng)基；(3)0.125 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培養(yǎng)基。將制備好的卵巢組織塊依次浸入ES和VS中室溫各平衡10 min。最后浸入盛有0.5 ml VS冷凍液的2.5 ml凍存管10 min后，迅速投入液氮罐中(-196℃)。復(fù)蘇冷凍組織時(shí)取出冷凍管后迅速擰松管口，放人37℃水浴箱中1 min左右至冷凍液溶解。將B組組織依次放入解凍液(1)(2)(3)各5 min，最后用培養(yǎng)液沖洗3遍。

1.4.3程序化冷凍法冷凍方法參考Newton等[2,8]的慢速程序冷凍法：將卵巢組織投入含1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L S+10 mg/ml HSA的PBS液中，室溫平衡90 min，裝入0.5 ml冷凍管中放于程序冷凍儀上，從室溫開(kāi)始以2℃/min降至-7℃，人工植冰，再以0.3℃/min的降溫速率降至-30℃，以l0℃/min的降溫速率降至-120℃，投入液氮中冷凍保存。復(fù)溫方法：將冷凍管自液氮罐中取出，置入37℃水浴箱中2～3 min，室溫中按含1.0 mol/L PROH、0.5 mol/L PROH的PBS液梯度遞減洗脫冷凍保護(hù)劑各3遍，將組織移入含5%HSA的PBS液中完成復(fù)溫。

1.5組織學(xué)形態(tài)學(xué)分析將固定好的組織塊脫水透明，石蠟包埋后，4μm 厚連續(xù)切片，作HE染色分析。根據(jù)Gougeon[9]分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)卵泡。正常卵泡結(jié)構(gòu)為完整的圓形細(xì)胞核，核仁清晰及顆粒細(xì)胞分布均勻，卵泡基底膜完整。形態(tài)異常的卵泡，表現(xiàn)為基底膜不完整，顆粒細(xì)胞分散，周?chē)|(zhì)中出現(xiàn)空泡。所有組織塊均進(jìn)行連續(xù)切片，為避免卵泡重復(fù)計(jì)數(shù)，每隔10張切片取1張固定，于400倍倒置顯微鏡(Olympus IX81，日本)下隨機(jī)觀(guān)察10個(gè)視野，以卵母細(xì)胞核仁為標(biāo)記計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡，并計(jì)算形態(tài)正常卵泡比率。正常形態(tài)卵泡比率為：(正常形態(tài)卵泡數(shù)/正常形態(tài)卵泡數(shù)+形態(tài)改變卵泡數(shù))×100%。

1.6TUNEL檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒內(nèi)提供的切片，陰性對(duì)照則用蒸餾水替代TdT。結(jié)果判定：①200×倒置顯微鏡下，已凋亡細(xì)胞胞核著色為棕黃色或褐色，細(xì)胞核染為藍(lán)色的為有活性的細(xì)胞。②凋亡陽(yáng)性始基卵泡：參照Raffaell所述標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)始基卵泡中卵母細(xì)胞染色陽(yáng)性和(或)超過(guò)50%顆粒細(xì)胞染色陽(yáng)性，則記錄為凋亡陽(yáng)性[10]。③參照Kim所述方法，間質(zhì)凋亡陽(yáng)性率=染色陽(yáng)性的間質(zhì)細(xì)胞面積/組織總面積×100%[11]。因竇卵泡與黃體會(huì)出現(xiàn)生理性凋亡而影響結(jié)果，所以這些結(jié)構(gòu)不包含在細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色計(jì)數(shù)內(nèi)。凋亡細(xì)胞的比率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總的細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。各組正常與異常卵泡比率及細(xì)胞凋亡比率的比較用χ2檢驗(yàn)。顯著性水平為α=0. 05。

2結(jié)果

2.1卵巢組織學(xué)評(píng)價(jià)在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，冷凍后的人卵巢組織與冷凍前相比，大多數(shù)始基卵泡形態(tài)基本保存滿(mǎn)意，4組始基卵泡和初級(jí)卵泡的異常形態(tài)卵泡比率見(jiàn)表1。各組冷凍后始基卵泡和初級(jí)卵泡的異常形態(tài)卵泡率較新鮮組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在各冷凍組間比較，兩步法冷凍組始基卵泡和初級(jí)卵泡的異常形態(tài)卵泡率比較玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。玻璃化冷凍組始基卵泡異常形態(tài)率低于程序化冷凍組(P<0.05)，初級(jí)卵泡異常形態(tài)率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　不同冷凍方案各級(jí)卵泡的異常形態(tài)率(n，%)

注：*：與新鮮組相比，P<0.05；#：與玻璃化冷凍組和程序化冷凍組相比，P<0.05；△：與程序化冷凍組相比，P<0.05。

2.2卵巢組織細(xì)胞凋亡分析TUNEL檢測(cè)各組卵巢皮質(zhì)中始基卵泡凋亡情況發(fā)現(xiàn)，各組冷凍后凋亡發(fā)生率較新鮮組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在各冷凍組間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)于卵巢間質(zhì)細(xì)胞凋亡分析可見(jiàn)，各冷凍組間質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生率較新鮮組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；在各冷凍組間比較，兩步法冷凍組間質(zhì)細(xì)胞凋亡率較玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。玻璃化冷凍組和程序化冷凍組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2　各冷凍組及新鮮組始基卵泡和間質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生率

注：*：與新鮮組相比，P<0.05；#：與玻璃化冷凍組和程序化冷凍組相比，P<0.05。

3討論

卵巢組織冷凍是保護(hù)女性病人生殖內(nèi)分泌功能的一種重要方式。目前常用的卵巢組織冷凍方法是玻璃化冷凍和程序化冷凍法，但哪一個(gè)冷凍方案更適合凍融卵巢，并沒(méi)有統(tǒng)一定論。Keros等[13]發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍比程序化冷凍能更好的保存卵巢組織的鏡下形態(tài)，尤其是卵巢基質(zhì)細(xì)胞。但也有文獻(xiàn)報(bào)道程序化冷凍卵巢組織的冷凍效果比玻璃化冷凍法更好[14]。尋找理想的卵巢組織冷凍保存方案一直是各科研工作者努力研究的方向。本研究探討了一種新的冷凍方案即兩步法冷凍卵巢組織的冷凍效果，并和玻璃化冷凍法和程序化冷凍法進(jìn)行了比較。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩步冷凍法始基卵泡和初級(jí)卵泡的異常形態(tài)卵泡率比較玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，對(duì)卵泡組織形態(tài)的保存優(yōu)于另外兩種方法。玻璃化冷凍效果不如兩步冷凍法可能是因?yàn)椴ＡЩ鋬鲆好芏容^大，不能迅速滲入大塊組織，整塊組織細(xì)胞內(nèi)的水分不能均勻形成玻璃化狀態(tài)。尤其對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織，降溫速率快使細(xì)胞內(nèi)水分無(wú)法達(dá)到平衡狀態(tài)引起細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，高濃度的冷凍保護(hù)劑也增加了細(xì)胞內(nèi)毒性損傷以及滲透性損傷。而兩步冷凍法中冷凍保護(hù)劑濃度較低，降低了溶質(zhì)損傷與細(xì)胞毒性損傷；低濃度冷凍保護(hù)劑在慢速降溫過(guò)程中，使細(xì)胞外冰晶形成早于細(xì)胞內(nèi)，從而細(xì)胞外環(huán)境中水分減少滲透壓升高，胞內(nèi)脫水，防止了胞內(nèi)冰晶形成[15]。

本研究中進(jìn)一步分析了始基卵泡和卵巢間質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。凋亡是細(xì)胞程序化的死亡，細(xì)胞自身調(diào)控通過(guò)激活細(xì)胞核內(nèi)核酸內(nèi)切酶，而引起小分子DNA斷裂。TUNEL檢測(cè)則是利用這種DNA片段來(lái)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，從而評(píng)估卵巢組織凍融前后的損傷情況[16]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，各冷凍組卵巢皮質(zhì)中始基卵泡凋亡情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)于卵巢間質(zhì)細(xì)胞，兩步法冷凍組間質(zhì)細(xì)胞凋亡率較玻璃化冷凍組和程序化冷凍組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果說(shuō)明兩步冷凍法能更好的保護(hù)卵泡周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞。

總之，本研究結(jié)果顯示，卵巢組織能夠很好的耐受冷凍損傷，通過(guò)冷凍保存可以保存大部分卵泡活性。兩步冷凍法比玻璃化冷凍法及程序化冷凍法冷凍更有利于卵泡正常形態(tài)的維持并降低間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而為卵巢組織冷凍提供了新的方案。

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Effects of three different freezing methods on the follicularmorphology and apoptosis of human ovarian tissues

ZHAOShu-qinQIUXue-meiDINGChenWANGLeiHUANGShu-juanMAZhao-wen

(Maternal and Child Health Care Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277100，China)

Abstract:Objective：To compare the cryopreservation effect of two-step freezing, vitrification and slow programmed cooling in order to explore a more effective method for human ovarian tissue cryopreservation. Methods：6 samples of adult ovarian tissue were collected and divided into 4 groups randomly：the two-step freezing group, the vitrification group, the slow programmed cryopreservation group and the fresh group．Stromal cells and follicles in ovarian cortical tissues were analyzed by histological analysis．Follicles apoptosis were analyzed by TUNEL assay． Results：The two-step freezing group showed a significant lower percentage of abnormal morphology of follicles (Primordial and Primary) than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group. In the percentage of abnormal morphology of primary follicles，the vitrification group showed no significant differences with the slow programmed cryopreservation group, and showed a significant lower percentage of abnormal morphology of primordial follicles than the slow programmed cryopreservation group. In the percentage of apoptotic follicles, there was no significant difference among three cryopreservation groups (P>0.05)．In ovarian stroma cells, the two-step freezing group showed a significant lower apoptotic percentage than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group, and there was no significant difference between the vitrification group and the slow programmed cryopreservation group.Conclusion：Morphology of most follicles can remain normal after human ovarian tissues are frozen and thawed, and the two-step freezing method is better than vitrification and slow programmed cooling.

Key words:ovarian tissue；vitrification；two-step freezing；slow programmed cryopreservation；human

(收稿日期2015-12-18)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.03.001

中圖分類(lèi)號(hào)：R711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2016)03-0241-04

作者簡(jiǎn)介：趙淑芹(1966-)，女，主任醫(yī)師，碩士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)臨床和研究工作。

*基金資助：山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(2009GG20002079)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HM067)。