周俊雄, 馬榮琴, 李冬松, 田容川, 李敏昱, 羅藝彬, 劉平平, 田寶玉

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108;2.福州時(shí)代中學(xué)，福建 福州 350007)

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家養(yǎng)禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性的種類、數(shù)量和分布

周俊雄1, 馬榮琴1, 李冬松1, 田容川2, 李敏昱1, 羅藝彬1, 劉平平1, 田寶玉1

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350108;2.福州時(shí)代中學(xué)，福建 福州 350007)

摘要:采用微生物培養(yǎng)和影印法對(duì)家養(yǎng)禽類雞、鴨和肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性的種類、數(shù)量和分布進(jìn)行了調(diào)查.結(jié)果表明：在調(diào)查的雞、鴨和肉鴿3種禽類中，腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性的分布非常普遍，所有測試細(xì)菌至少可以抗一種抗生素，抗5種以上抗生素的細(xì)菌占測試細(xì)菌的比例分別為75.0%、58.9%和97.4%；個(gè)別細(xì)菌對(duì)測試的10種抗生素均具有抗性.在抗生素方面，腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)萘啶酮酸、鹽酸四環(huán)素、鹽酸克林霉素、磺胺嘧啶和紅霉素的抗性分布比較廣泛.提取細(xì)菌基因組并擴(kuò)增16S rRNA基因，并對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定的結(jié)果表明，分離的腸道可培養(yǎng)細(xì)菌為埃希氏大腸桿菌.在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步搜索的結(jié)果顯示：與腸道可培養(yǎng)細(xì)菌同源性大于99%的細(xì)菌廣泛分布于不同的環(huán)境、宿主和病原菌中，表明這些腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性是一個(gè)潛在的環(huán)境微生物以及人體病原菌抗生素抗性的傳播來源.

關(guān)鍵詞:抗生素; 家養(yǎng)禽類; 腸道可培養(yǎng)細(xì)菌; 抗藥性; 大腸桿菌

抗生素自上世紀(jì)40年代被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)入臨床醫(yī)療以來，一直作為抗感染治療的最主要手段，拯救了千百萬人的生命，被譽(yù)為人類20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一[1].在過去的幾十年間,新的抗生素不斷被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)入臨床;抗生素的應(yīng)用范圍也由原來的人畜感染控制發(fā)展到水產(chǎn)養(yǎng)殖等，還被作為飼料添加劑和促生長劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)并進(jìn)入環(huán)境中，導(dǎo)致環(huán)境中抗生素抗性細(xì)菌和抗性基因日益增加，從而影響生態(tài)環(huán)境和人類健康[2- 3].中國是抗生素生產(chǎn)大國，也是抗生素使用大國.根據(jù)化學(xué)工業(yè)學(xué)會(huì)和制藥工業(yè)學(xué)會(huì)2005年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國每年抗生素原料生產(chǎn)量約為21萬t，其中很大一部分，約有9.7萬t(占46.1%)用于畜牧業(yè)[4].研究表明，長期廣泛使用抗生素的直接后果很可能引起動(dòng)物體內(nèi)抗性基因通過排泄物對(duì)養(yǎng)殖區(qū)域周邊環(huán)境造成基因污染，導(dǎo)致環(huán)境中病原菌抗生素抗性普遍增強(qiáng),抗生素的治療效果日益下降,對(duì)人和動(dòng)物的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[2-5]，臨床感染性疾病的治療也將面臨巨大的挑戰(zhàn).隨著抗生素的使用,抗性細(xì)菌在數(shù)量、多樣性以及抗性強(qiáng)度上也都將顯著增大.

目前,幾乎臨床上使用的所有抗生素都有其抗性細(xì)菌,多重耐藥菌株的檢出也相當(dāng)普遍,甚至出現(xiàn)了能抵抗絕大多數(shù)抗生素的“超級(jí)細(xì)菌”.廣泛存在且不斷增長的細(xì)菌抗生素抗性或?qū)⒊蔀槲覈称钒踩腿祟惤】殿I(lǐng)域的最主要威脅之一[5].2010年出現(xiàn)的“超級(jí)細(xì)菌”就是細(xì)菌多重抗性的典型實(shí)例，其攜帶有耐藥基因NDM-1，能夠編碼金屬β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解大多數(shù)抗生素，導(dǎo)致由該類細(xì)菌引起的感染性疾病難以醫(yī)治[6-7].廣泛存在的抗生素抗性細(xì)菌和由此導(dǎo)致的嚴(yán)重危害提出了這樣的疑問：如此多樣且廣泛存在的病原菌抗性從哪里來？為什么短短幾十年的抗生素應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中病原菌抗性的爆發(fā)？

本試驗(yàn)采微生物培養(yǎng)、影印法和細(xì)菌16S rDNA分子鑒定等方法，對(duì)市場上出售的雞、鴨和肉鴿3種禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的抗生素抗性的種類、多樣性和生態(tài)分布進(jìn)行了調(diào)查，通過搜索美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫同源細(xì)菌的環(huán)境分布，探索家養(yǎng)禽類腸道細(xì)菌的抗生素抗性與環(huán)境微生物以及人體病原菌抗性起源和相互傳播的相關(guān)性.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集試驗(yàn)所用新鮮雞、鴨和肉鴿糞便均來自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，對(duì)于每一種調(diào)查的家禽種類，均保證收集的糞便來自5個(gè)或5個(gè)以上不同的個(gè)體.采集的新鮮糞便分別用密封袋密封，用記號(hào)筆標(biāo)記采集地點(diǎn)、采集日期和采集人，置4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆?采集的樣品在24 h內(nèi)處理完畢.

固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，含10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸出粉、10 g NaCl和15 g瓊脂粉，以蒸餾水定容至1 L，pH為7.0，于1×105Pa滅菌20 min，備用.

1.2方法

1.2.1樣品處理稱取新鮮雞、鴨和肉鴿的糞便各5 g，分別放入盛有25 mL無菌生理鹽水并帶有3~5粒玻璃珠的三角燒瓶中，旋轉(zhuǎn)振蕩使糞便與無菌生理鹽水充分混勻，靜置5 min.移取1.0 mL糞便上清液進(jìn)行梯度稀釋,分別吸取不同稀釋梯度的溶液100 μL，涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h.以平板上150~200個(gè)菌落為標(biāo)準(zhǔn)，確定稀釋梯度.按預(yù)試驗(yàn)確定的稀釋梯度將不同糞便上清液分別稀釋后再次涂布在至少5個(gè)LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài).

1.2.2可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化分別從每個(gè)樣品稀釋平板上隨機(jī)挑取200~250個(gè)單菌落，在平板上劃線挑取單克隆.選取的單克隆再次劃線，經(jīng)過兩次純化，保證得到單一純化的菌株.純化的菌株分別進(jìn)行顯微觀察，按菌落形態(tài)、顏色和大小分別歸類，并分別接種到LB液體培養(yǎng)基上，于37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)24 h，按20%的比例加入適量甘油，置-20 ℃冰箱保種.

1.2.3抗生素儲(chǔ)備液的制備按要求將10種抗生素(表1)制成儲(chǔ)備液[8]，過濾除菌后置-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.4影印平板試驗(yàn)分別移取50 μL單菌落菌液于對(duì)應(yīng)的96孔板，備用.分別配置表1中所需工作濃度的抗生素LB固體培養(yǎng)基方形平板，冷卻備用.用帶有96針的影印工具蘸取適量菌液，分別點(diǎn)于含有10種抗生素的方形LB固體平板上，將平板置于37 ℃培養(yǎng)12~16 h.觀察平板菌落的生長情況并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各菌株對(duì)每種抗生素是否具有抗藥性，并據(jù)此計(jì)算各個(gè)樣品分離的細(xì)菌對(duì)各種抗生素的抗性比例.抗性比例/%=具有抗性的菌株數(shù)/總測試菌株數(shù)×100.

表1　10種抗生素的工作濃度

1.2.5腸道可培養(yǎng)細(xì)菌基因組DNA的提取為了確定分離純化的3種禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的種類，純化的細(xì)菌菌落根據(jù)菌落大小分為2~3類.在每一類中隨機(jī)挑選5株菌株作為代表性菌株進(jìn)行基因組提取、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增以及測序.

比喻要生動(dòng)形象，才能觸動(dòng)心靈?！渡摹半娏俊薄芬徽n中，丁老師用圖片“你的生命還剩多少‘電量’”來比喻：中國人口平均壽命，男性74歲，女性77歲。每個(gè)人生命“電量”的余量：“10后”剩 69年，“00后”剩 59年，“90 后”剩 49年，“80后”還有 39年，“70后”還有 29 年，“60后”還有 19年，“50后”還有9年。這個(gè)比喻借助圖片表現(xiàn)，特別生動(dòng)形象，讓學(xué)生有一種緊迫感。而不同年齡段生命“電量”的展示，讓孩子產(chǎn)生聯(lián)想，有更多的思考。

將挑取的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)過夜.取1.5 mL菌液，于8 000 r·min-1離心5 min，去上清液.基因組的提取采取改良的酚氯仿法抽提，基本過程如下：在細(xì)胞沉淀中加入750 μL裂解緩沖液，槍頭吹打混勻后加入少許石英砂和400 μL酚/氯仿，渦旋振蕩3 min，于11 000 r·min-1離心5 min，棄沉淀.將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的1.5 mL管中，加入等體積的酚/氯仿，翻轉(zhuǎn)5次，靜置5 min，于11 000 r·min-1離心5 min.將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的1.5 mL管中，按50.0 μg·mL-1的工作濃度加入適量RNase，于37 ℃水浴1 h.之后按80.0 μg·mL-1的工作濃度加入適量蛋白酶K，于55 ℃水浴30 min，再次加入等體積的氯仿翻轉(zhuǎn)5次，靜置5 min，于11 000 r·min-1離心5 min.將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的1.5 mL管中，加入等體積的異丙醇，在-20 ℃靜置1 h，于13 000 r·min-1離心15 min.棄上清液，沉淀用1 mL 70%乙醇洗兩次，加入50 μL TE緩沖液(pH 7.5)溶解，置-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?提取的基因組DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量.

1.2.6腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建以提取的腸道可培養(yǎng)細(xì)菌基因組為模板，采用通用引物27f/1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因[9].PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序，獲得的序列遞交至RDP數(shù)據(jù)庫確定其分類地位.同時(shí)在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)各個(gè)序列進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，篩選同源序列.將分離純化的16S rRNA基因序列與下載的同源序列通過SeaView軟件的ClustalX程序進(jìn)行完全比對(duì).編輯后用SeaView軟件的Tree程序構(gòu)建PhyML系統(tǒng)進(jìn)化樹[10].

2結(jié)果與分析

2.1雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性

2.1.1雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性比例研究表明，盡管動(dòng)物腸道微生物主要由嚴(yán)格或兼性厭氧微生物構(gòu)成，好氧條件下的細(xì)菌在抗生素抗性的獲得和傳播中扮演了更為重要的作用[11-12].對(duì)分離純化的192株細(xì)菌的抗生素抗性進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果(圖1)表明：在192株細(xì)菌中，對(duì)萘啶酮酸、鹽酸四環(huán)素、磺胺嘧啶和紅霉素表現(xiàn)出較高的抗性比例，分別為70.8%、77.1%、81.3%和71.9%，對(duì)磺胺嘧啶的抗性比例最高；對(duì)硫酸鏈霉素和頭孢氨芐的抗性比例較低，只有20.3%的細(xì)菌對(duì)頭孢氨芐具有抗性.在雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中，對(duì)抗生素具有抗性的細(xì)菌比例與該抗生素在市場中的應(yīng)用時(shí)間相關(guān)，一些較早引入市場以及畜牧養(yǎng)殖的抗生素，如磺胺嘧啶和鹽酸四環(huán)素具有較高的抗性比例；一些新抗生素，如頭孢氨芐則抗性比例較低.

2.1.2雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶抗生素抗性的數(shù)目具有多重抗性的細(xì)菌，即“超級(jí)細(xì)菌”是醫(yī)療實(shí)踐中造成抗生素治療失敗的主要原因.圖2表明，192株雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌均對(duì)一種或一種以上的抗生素產(chǎn)生抗性，大多數(shù)細(xì)菌攜帶抗生素抗性的數(shù)目在4~7個(gè)之間，攜帶5個(gè)以上抗生素抗性的細(xì)菌一共有139株，占總檢測細(xì)菌數(shù)目的72.4%，說明多重耐藥細(xì)菌在雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中比較普遍.

2.2鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性

2.2.1鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性比例對(duì)分離純化的192株細(xì)菌的抗生素抗性進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果(圖3)表明：對(duì)抗生素具有抗性的細(xì)菌在鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中的分布也較為廣泛，但抗性比例明顯低于雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，其中對(duì)氯霉素、紅霉素、氨芐青霉素鈉、磺胺嘧啶和硫酸鏈霉素的抗性比例相對(duì)較高，在50%以上；對(duì)頭孢氨芐的抗性比例較低，只有29.2%.鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的抗性比例普遍低于雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的主要原因可能與鴨的飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)開放有關(guān)，流動(dòng)的水生環(huán)境避免了抗性細(xì)菌在鴨飼養(yǎng)環(huán)境中的進(jìn)一步富集；另一方面，這些抗性細(xì)菌也可能在更為廣泛的環(huán)境中進(jìn)行擴(kuò)散和傳播.

2.2.2鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶抗生素抗性的數(shù)目圖4表明：192株鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌均對(duì)一種或一種以上的抗生素產(chǎn)生抗性，大多數(shù)細(xì)菌攜帶抗生素抗性的數(shù)目在4~6個(gè)之間；攜帶4個(gè)以上抗生素抗性的細(xì)菌一共有150株，占總檢測細(xì)菌數(shù)目的78.1%，攜帶5個(gè)以上抗生素抗性的細(xì)菌占總檢測細(xì)菌數(shù)目的58.9%，有3株細(xì)菌對(duì)9種抗生素表現(xiàn)出明顯的抗性.

2.3肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性

2.3.1肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性比例從分離純化的肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中隨機(jī)挑取240株菌株用于抗生素抗性調(diào)查.結(jié)果(圖5)表明：在調(diào)查的3種禽類中，肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)抗生素具有抗性的細(xì)菌比例最高，對(duì)10種抗生素的抗性比例均在80%以上，其中對(duì)磺胺嘧啶和鹽酸克林霉素的抗性比例最高，分別達(dá)到了90.8%和93.3%；同樣，對(duì)一些目前臨床上尚在應(yīng)用一線的新抗生素，如頭孢類抗生素，抗性比例也達(dá)到了82.1%，這與其他動(dòng)物腸道中絕大多數(shù)細(xì)菌對(duì)頭孢類抗生素較為敏感不一致.肉鴿腸道中高抗性細(xì)菌比例可能主要與其較短的飼養(yǎng)周期有關(guān).肉鴿的飼養(yǎng)周期一般在45 d左右，而乳鴿只需25~30 d哺喂即可上市.較短的飼養(yǎng)周期可能導(dǎo)致較高的抗生素殘留以及較高的抗性比例.這個(gè)結(jié)果與先前對(duì)蜜蜂腸道可培養(yǎng)細(xì)菌抗生素抗性的調(diào)查結(jié)果是一致的，新購自于種蜂場的蜂群腸道細(xì)菌對(duì)抗生素具有較高的抗性比例[9].

2.3.2肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶抗生素抗性的數(shù)目圖6表明：與高的抗性細(xì)菌比例一致，肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌也攜帶有較多的抗生素抗性種類，多種抗性更為普遍；240株細(xì)菌均對(duì)3種或3種以上的抗生素產(chǎn)生抗性，攜帶5種及5種以上抗生素抗性的細(xì)菌占總檢測細(xì)菌數(shù)目的97.4%，攜帶7種以上抗生素抗性的細(xì)菌占總檢測細(xì)菌數(shù)目的85%，說明多重抗性細(xì)菌在肉鴿腸道中分布非常普遍，共有66株細(xì)菌對(duì)10種抗生素均表現(xiàn)出抗性.

2.4腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

3種禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌根據(jù)其菌落形狀、顏色和大小分為2~3類，在每一類中隨機(jī)挑選5株細(xì)菌進(jìn)行基因組提取，每個(gè)樣品挑取10~15株細(xì)菌作為代表性菌株.以提取的基因組DNA為模板，采用通用引物27f/1492r擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因.純化回收后的16S rRNA基因經(jīng)測序，最終有21個(gè)樣品雙向測序成功并得到全長序列，測序成功的序列遞交RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子鑒定.鑒定結(jié)果表明，3種禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌均屬于腸桿菌科埃希氏大腸桿菌.序列比對(duì)結(jié)果表明，大部分同一來源的細(xì)菌16S序列完全一致.在隨后的分析中將序列完全一致的細(xì)菌合并，最終確定8株作為代表性菌株，包括5株雞腸道可培養(yǎng)細(xì)菌(雞_C20、 雞_J29、 雞_J79、 雞_C4、 雞_C161)、2株鴨腸道可培養(yǎng)細(xì)菌(鴨_110、鴨_10)和1株鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌(鴿_G2).8株代表性菌株的16S rRAN基因全長序列用于下一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

將8株代表性菌株的16S rRNA基因序列在NCBI nt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選取并下載序列同源以及腸桿菌科主要屬典型菌株的16S rRNA基因序列，采用SeaView軟件的ClustalX程序?qū)⒛康男蛄信c已知的腸桿菌科16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，編輯后用SeaView軟件的Tree程序構(gòu)建PhyML系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7).從圖7可以看出，3種禽類可培養(yǎng)細(xì)菌都聚集在腸桿菌科的埃希氏菌屬—志賀氏菌屬分枝上，顯示了這些來源于不同家禽并攜帶有多種耐藥性的細(xì)菌高度同源，彼此間具有很近的親緣關(guān)系.

2.5腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在環(huán)境中的分布及其抗性的潛在傳播途徑

為了調(diào)查3種禽類腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在環(huán)境中可能的分布及其抗性的潛在傳播途徑，本試驗(yàn)收集和統(tǒng)計(jì)了NCBI數(shù)據(jù)庫中與腸道可培養(yǎng)大腸桿菌序列具有高度同源性的細(xì)菌16S rRNA基因序列(序列同源性>99%)，并統(tǒng)計(jì)了這些序列的來源與分布信息.結(jié)果表明，NCBI數(shù)據(jù)庫中報(bào)道了大量的與腸道可培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性大于99%的細(xì)菌，這些細(xì)菌廣泛分布于世界各地，以亞洲、歐洲和北美洲分布最多，且分布在不同環(huán)境中，從沿海到內(nèi)陸，從表層海水到海底熱泉沉積物，從熱帶到寒帶均有分布.根據(jù)這些細(xì)菌所分布的環(huán)境以及這些環(huán)境之間的相互關(guān)聯(lián)，構(gòu)建了細(xì)菌在不同環(huán)境之間可能存在的交流和傳播網(wǎng)絡(luò)(圖8).

前期研究表明，病原菌主要是通過基因水平轉(zhuǎn)移從同一或親緣關(guān)系較近的攜帶有抗性基因的細(xì)菌類群中獲得抗性基因.動(dòng)物腸桿菌類細(xì)菌很可能是抗性基因傳播以及人體病原菌獲得抗性基因的重要載體.

一方面，大腸桿菌具有非常廣泛的分布范圍，能夠適應(yīng)從動(dòng)物腸道到自然的土壤、水等多樣性的環(huán)境，而頻繁的人口流動(dòng)為這些細(xì)菌的廣泛傳播提供了便利條件；其次，Sommer et al[13]研究表明，病原菌攜帶的抗性基因與腸道可培養(yǎng)細(xì)菌(通常為兼性厭氧細(xì)菌，或者是機(jī)會(huì)致病菌)以及環(huán)境中的同類細(xì)菌具有高度的同源性，說明病原菌可能從腸道可培養(yǎng)細(xì)菌獲得抗性基因以及這些抗性基因的環(huán)境來源.因此，環(huán)境中不同來源的大腸桿菌相互傳播和交流的網(wǎng)絡(luò)也很有可能成為耐藥性基因在不同環(huán)境微生物和人類病原菌相互傳播的潛在途徑[3].

3討論

長期以來，畜禽養(yǎng)殖過程中抗生素的使用一直被認(rèn)為是除醫(yī)療應(yīng)用之外，病原菌和環(huán)境微生物耐藥性增加的另一個(gè)重要原因[2-3,12-14].近年來隨著畜牧養(yǎng)殖集約化發(fā)展，抗生素濫用情況日益嚴(yán)重，直接后果很可能導(dǎo)致在動(dòng)物腸道微生物中產(chǎn)生豐富的抗性耐藥菌，這些抗性菌株通過排泄物及畜牧活動(dòng)擴(kuò)散到環(huán)境中，并在環(huán)境中傳播擴(kuò)散[2,5,13-15].

本試驗(yàn)結(jié)果表明：3種禽類腸道存在普遍而種類繁多的抗抗生素細(xì)菌；所有測試細(xì)菌至少對(duì)一種或一種以上的抗生素具有抗性，不同來源的動(dòng)物腸道細(xì)菌對(duì)不同種類抗生素的抗性具有明顯差異.雞腸道的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)萘啶酮酸、鹽酸四環(huán)素、鹽酸克林霉素、磺胺嘧啶和紅霉素具有較高的抗性，對(duì)頭孢氨芐比較敏感；鴨腸道的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素鈉、氯霉素、硫酸鏈霉素、磺胺嘧啶和紅霉素具有抗性，對(duì)環(huán)丙沙星鹽酸鹽比較敏感；而肉鴿腸道的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)測試的10種抗生素均具有明顯的抗性.3種禽類腸道中抗抗生素細(xì)菌的比例以及這些細(xì)菌對(duì)不同抗生素抗性的差異可能與家禽的飼養(yǎng)方式以及抗生素的使用時(shí)間有關(guān).在3種禽類中，鴨的飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)較為開放，飼養(yǎng)周期長，避免了抗性細(xì)菌在一個(gè)較為狹小環(huán)境下的富集，因此抗性比例和抗抗生素的數(shù)目都較低；而肉鴿飼養(yǎng)環(huán)境狹小，大腸桿菌在環(huán)境、飲用水、飼料和灰塵中高度富集，且肉鴿飼養(yǎng)周期短，只有25~30 d，在飼養(yǎng)過程中一旦使用抗生素會(huì)有較高的殘留而導(dǎo)致抗性細(xì)菌的富集[16-17].

從3種禽類糞便中分離得到的細(xì)菌菌株經(jīng)分子鑒定均為大腸桿菌，這些菌株的16S rRNA基因序列相互之間的同源性大于99%.前期研究表明，盡管大腸桿菌以及其他腸桿菌科細(xì)菌在腸道微生物中所占的比例不到1%，但長期以來這些兼性厭氧細(xì)菌一直被認(rèn)為是抗生素抗性細(xì)菌的一個(gè)主要來源和傳播介質(zhì)[18-19].一個(gè)重要的原因是這些細(xì)菌在環(huán)境中廣泛分布，從土壤、水生環(huán)境到腸道環(huán)境都可以檢測到這些細(xì)菌的存在，因此，大腸桿菌也被廣泛用作檢測食品和飲用水是否污染的一個(gè)重要指標(biāo)[19]；另一個(gè)原因是這些細(xì)菌攜帶大量種類豐富的抗生素抗性基因[15，19].本試驗(yàn)中，雞、鴨和肉鴿腸道可培養(yǎng)細(xì)菌大多數(shù)具有多重耐藥性，攜帶5種或5種以上抗生素抗性的細(xì)菌分別占總檢測細(xì)菌數(shù)目的72.4%、58.8%和97.5%.前人對(duì)不同來源大腸桿菌耐藥性的調(diào)查也證實(shí)了這一點(diǎn).如宋立等[20]對(duì)我國1970~1990年和2000年收集的326株食品動(dòng)物大腸桿菌的抗性調(diào)查表明,食品動(dòng)物大腸桿菌對(duì)青霉素類、四環(huán)素類、氨基糖甙類、氟喹諾酮類、磺胺類和氯霉素類抗生素都有較高的耐藥率.而據(jù)國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心對(duì)1986年分離的71株和2001年分離的86株正常豬糞便大腸桿菌抗生素耐藥性的調(diào)查表明,這些菌株對(duì)環(huán)丙沙星、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺嘧啶、鏈霉素和慶大霉素等都有明顯的耐藥性[21].多抗耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)可能與不同的抗生素抗性基因之間存在連鎖現(xiàn)象有關(guān).研究表明，環(huán)境中存在種類繁多且濃度較高的抗生素時(shí)，一種抗生素對(duì)其他種類的抗生素抗性基因可能具有協(xié)同誘導(dǎo)作用[22].Brenciani et al[23]發(fā)現(xiàn)，在125株攜帶大環(huán)內(nèi)脂類抗生素抗性基因erm(B)的釀膿葡萄球菌中，有117株也攜帶四環(huán)素抗性基因tet(M)，并證明基因erm(B)和tet(M)是連鎖的.Levy et al[15]發(fā)現(xiàn)，用添加亞治療劑量土霉素的飼料喂養(yǎng)的雞的排泄物中，大腸桿菌不僅具有土霉素抗性，還具有鏈霉素、磺胺嘧啶和氨芐青霉素抗性.因此，分布普遍而又?jǐn)y帶廣泛耐藥性的腸桿類細(xì)菌已經(jīng)成為近年來研究細(xì)菌耐藥性進(jìn)化和傳播的主要關(guān)注熱點(diǎn).

微生物耐藥性可以通過垂直和水平轉(zhuǎn)移兩種機(jī)制在微生物間傳播.垂直轉(zhuǎn)移指抗性基因由親代傳給子代，具有典型的種屬特異性;水平轉(zhuǎn)移則是指抗性基因通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)化作用在親緣關(guān)系較近的微生物之間傳播.研究表明，即使在幾乎沒有人為影響的環(huán)境中也存在多種抗生素抗性細(xì)菌，其所攜帶的抗性基因與臨床上發(fā)現(xiàn)的致病菌攜帶的抗性基因具有高度的一致性，這主要就是抗性基因之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果[12,15,24-25].然而，研究表明抗性基因的水平轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在親緣關(guān)系較近的種內(nèi)或種間.如盡管在人類腸道微生物占絕對(duì)優(yōu)勢的未培養(yǎng)厭氧細(xì)菌(如擬桿菌等)也攜帶許多抗性基因.序列分析表明，病原菌的抗性基因與那些可培養(yǎng)的兼性厭氧菌所攜帶的抗性基因序列更相似.Sommer et al[13]通過分析人體腸道微生物中可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶的抗性基因序列(主要是腸桿菌)以及通過功能宏基因組學(xué)手段得到的未培養(yǎng)細(xì)菌的抗性基因序列發(fā)現(xiàn)，病原菌(如肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌)與可培養(yǎng)細(xì)菌攜帶的抗性基因序列具有高度的一致性，而與未培養(yǎng)細(xì)菌的抗性基因序列的同源性很低，說明病原菌主要通過水平轉(zhuǎn)移的方式從可培養(yǎng)的親緣關(guān)系較近的微生物中獲得抗性基因.在本試驗(yàn)中，不僅從3種不同飼養(yǎng)環(huán)境的禽類腸道細(xì)菌中分離得到的大腸桿菌菌株高度同源，而且這些細(xì)菌廣泛分布于不同的環(huán)境，包括豬、牛、雞等各種動(dòng)物糞便，土壤，水生環(huán)境中，表明微生物在不同動(dòng)物以及不同環(huán)境之間相互傳播，而且其所攜帶的抗性基因也可能隨著這些傳播途徑和傳播網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行擴(kuò)散和傳播.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Diversity and distribution of antibiotic resistance for gut culturable bacteria from domestic poultry

ZHOU Junxiong1, MA Rongqin1, LI Dongsong1, TIAN Rongchuan2,LI Minyi1, LUO Yibin1, LIU Pingping1, TIAN Baoyu1

(1.Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian 350108, China; 2.Fuzhou Era Middle School, Fuzhou, Fujian 350007, China)

Abstract:The wide-use, misuse and even abuse of antibiotics in recent years have led to an increase in the resistance of environmental and pathogenic microorganisms to antibiotics. In this study, diversity and ecological distribution of antibiotic resistances for culturable intestinal bacteria from domestic poultry, including chicken, duck and pigeon, were investigated using traditional microculture and replica plating techniques. Results showed that all the isolated bacteria were resistant to at least 1 of the 10 tested antibiotics. Proportions of bacteria which were resistant to greater than or equal to 5 antibiotics were 75%, 58.9% and 97.4% for chicken, duck and pigeon, respectively. And 66 out of 192 (34%) isolates were resistant to all the antibiotics. Moreover, a variety of bacteria, with the highest overall proportion in pigeon and lowest in duck, showed resistance to nalidixic acid, tetracyyline, clindamycin, sulfadiazine and erythromycin. In order to identify bacteria that presentd high and multi-drug antibiotic resistance, 16S rRNA genes of 8 representative strains were amplified and followed by phylogenetic analysis. It turned out that the bacteria were grouped into the branch of Escherichia coli under the family of Enterobacterium. Referring to database from National Center of Biotechnology Information (NCBI), sequences with 99% similarity with the 8 strains were widely distributed in a variety of environment, including soil, animal host and pathogenic bacteria. Results indicated that culturable gut bacteria from domestic poultry was a potential source of antibiotic resistance for environmental microbiota and human pathogenic bacteria.

Key words:antibiotics; domestic poultry; culturable intestinal bacteria; resistance; Escherichia coli

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.010

中圖分類號(hào):X171

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1671-5470(2016)01-0056-09

作者簡介:周俊雄(1989-)，男，碩士研究生.研究方向：應(yīng)用與環(huán)境微生物.Email：zhoujunxiong@sohu.com.通訊作者田寶玉(1973-)，男，副教授.研究方向：環(huán)境微生物.Email：tianby@fjnu.edu.cn.

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170108)；福建省杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2009J06014).

收稿日期：2015-01-23修回日期：2015-09-16