王淑琴，黃利鳴，錢洪鑫，李紅月

(1三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2武漢大學(xué)；3湖北社會(huì)主義學(xué)院)

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·臨床研究·

宮頸癌組織中APC、E-cadherin、ASC及FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化觀察

王淑琴1，黃利鳴2，3，錢洪鑫1，李紅月1

(1三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2武漢大學(xué)；3湖北社會(huì)主義學(xué)院)

摘要：目的觀察宮頸癌組織中結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、凋亡相關(guān)點(diǎn)狀蛋白(ASC)及脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。方法 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)檢測(cè)31例份宮頸癌組織和20例份正常宮頸上皮組織中的APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。分析APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果31例份宮頸癌組織中測(cè)得基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化27例份，其中APC、E-cadherin、ASC基因甲基化分別為19(61%)、17(55%)、6(19%)例份；單基因甲基化13例份，2個(gè)基因甲基化11例份，3個(gè)基因甲基化3例份。20例正常宮頸組織中均未測(cè)出基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。宮頸癌組織中APC、E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率高于正常宮頸組織(P均<0.05)。不同年齡、組織學(xué)分級(jí)及病理分期的宮頸癌患者腫瘤組織中APC、E-cadherin、ASC 基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 宮頸癌組織中APC、E-cadherin、ASC基因存在啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，可同時(shí)有多個(gè)基因甲基化。APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化可能參與了宮頸癌的發(fā)病。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；啟動(dòng)子區(qū)域甲基化；結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白；E-鈣黏蛋白；凋亡相關(guān)點(diǎn)狀蛋白；脆性組氨酸三聯(lián)體

近年來研究顯示，腫瘤發(fā)病與DNA甲基化模式異常有關(guān)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化是抑制基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制[1]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)宮頸癌基因甲基化的研究多數(shù)集中在單個(gè)基因，而后續(xù)研究提示宮頸癌可能同時(shí)存在多個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化。本研究觀察了宮頸癌組織中結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、凋亡相關(guān)點(diǎn)狀蛋白(ASC)及脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)，探討基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，分析基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取2013年12月~2014年5月手術(shù)切除或門診活檢取得的宮頸癌組織31例份，患者腫瘤臨床分期(FIGO)Ⅰ期16例、Ⅱ期13例、Ⅲ期2例，病理類型均為鱗狀上皮癌，組織學(xué)分級(jí)G14例、G215例、G312例?；颊吣挲g23~70歲,術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療。取同期良性病變行子宮切除術(shù)取得的20例份正常宮頸鱗狀上皮作對(duì)照。所有標(biāo)本取材后立即放入冰盒中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

1.2.1組織DNA提取采用常規(guī)的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法，無菌雙蒸水溶解后用紫外分光光度計(jì)定量蛋白。A260/A280為1.6~1.8，樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA的亞硫酸氫鹽修飾DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾后，樣品DNA中所有未甲基化的胞嘧啶將被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生變化。取2 μg DNA，按甲基化分析試劑盒說明的操作步驟進(jìn)行。

1.2.3甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)第一輪PCR反應(yīng)使用外側(cè)引物，反應(yīng)總體系25 μL, 包括經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾的DNA模版4 μL，10 mmol/L的dNTP 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物濃度10 pmol/L，Taq酶0.5 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋300倍，取4 μL進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，此反應(yīng)使用內(nèi)側(cè)引物，反應(yīng)總體系仍為25 μL，引物量為0.3 μL，其余不變，各基因的退火溫度與循環(huán)數(shù)見表1，其余反應(yīng)條件與第一輪PCR反應(yīng)相同。同時(shí)以人外周血淋巴細(xì)胞體外甲基化的DNA(IVD)作為陽(yáng)性對(duì)照，以正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA(NL)作為陰性對(duì)照，以水作空白對(duì)照。

1.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)2%含有溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)下觀察并照相。

表1　APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1宮頸癌組織中與正常宮頸組織中APC、E-cadherin、ASC、FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況31例份宮頸癌組織中測(cè)得基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化27例份，其中單基因甲基化13例份，2個(gè)基因甲基化11例份，3個(gè)基因甲基化3例份；APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化分別為19(61%)、17(55%)、6(19%)例份，而FHIT基因未檢測(cè)出甲基化。20例份正常宮頸組織中均未測(cè)出基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。宮頸癌組織中APC、E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率高于正常宮頸組織(P均<0.05)。

注：MW為DNA marker；IVD為甲基化陽(yáng)性對(duì)照；NL為甲基化陰性對(duì)照；H2O為空白對(duì)照；S為調(diào)查樣本；T為宮頸癌組織；N為正常宮頸組織。

圖1宮頸癌組織與正常宮頸組織中APC、E-cadherin、

ASC、FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢測(cè)結(jié)果

2.2APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系不同年齡、組織學(xué)分級(jí)及病理分期的宮頸癌患者腫瘤組織中APC、E-cadherin、ASC 基因甲基化狀態(tài)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2　APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化

3討論

基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基的過程。甲基化反應(yīng)不改變DNA序列和遺傳密碼，具有可逆性。人類許多基因中含有CpG序列密集區(qū)，稱為CpG島，常位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子內(nèi)，這些基因多為管家基因或組織特異表達(dá)基因。啟動(dòng)子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，基因可正常表達(dá)，當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí)則影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使基因表達(dá)沉默。一些腫瘤相關(guān)基因尤其是抑癌基因可因異常甲基化而失活，導(dǎo)致正常細(xì)胞生長(zhǎng)分化調(diào)控失常。研究發(fā)現(xiàn)，在人類腫瘤與變異細(xì)胞中存在DNA異常甲基化，如APC、VHL、E-cadherin、P16基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化[1~4]。

APC是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、遷移、信號(hào)傳遞等方面起著重要調(diào)控作用。APC基因失活使β-catenin蛋白降解障礙，導(dǎo)致游離β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚并易位入胞核，從而使Tcf/Lef激活，引起如c-myc、c-jun、Cyclin D1基因的異常轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變[5]。目前在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌及肝癌等惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)APC基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化[6，7]，而關(guān)于宮頸癌的研究較少。E-cadherin是一種與癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)的細(xì)胞黏附分子，E-cadherin表達(dá)下調(diào)將使細(xì)胞失去黏附，正常組織無法發(fā)育成形；對(duì)于惡性腫瘤，則細(xì)胞極性喪失、呈現(xiàn)惡性細(xì)胞形態(tài)并具備侵襲性生長(zhǎng)特征[8,9]。ASC是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其編碼的蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、激活Caspase和調(diào)節(jié)NF-κB活性等功能[10]。研究證實(shí)，在卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等腫瘤中存在ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域的頻繁甲基化。有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)乳癌細(xì)胞系甲基化誘導(dǎo)靜止基因(TMS1/ASC)表達(dá)缺失與TMS1/ASC基因CpG島高度甲基化相關(guān)。我們?cè)趯m頸癌組織中測(cè)出APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，且APC、E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢出率高于正常宮頸組織，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8，9]。

FHIT基因是近年來在染色體3p區(qū)域發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。但我們未在宮頸癌組織中測(cè)得FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，這與相關(guān)研究[12]結(jié)果不一致，可能與標(biāo)本取材、樣本數(shù)量有關(guān)，也可能與腫瘤組織中基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化不均質(zhì)性有關(guān)。

總之，宮頸癌組織中存在APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，提示在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中存在多個(gè)基因的異常甲基化，APC、E-cadherin、ASC基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化可能參與了宮頸癌的發(fā)病。

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(收稿日期：2015-11-06)

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)07-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.014

通信作者：錢洪鑫(E-mail: 3812501@qq.com)