劉寶欣，劉英宇，魏中秋，梁婷婷，范玉磊，楊方，孫影

(1華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院，唐山063000；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

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Prx-1基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、ROS水平、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

劉寶欣1，劉英宇1，魏中秋2，梁婷婷2，范玉磊2，楊方2，孫影2

(1華北理工大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院，唐山063000；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀察硫氧還原蛋白過氧化物酶1(Prx-1)基因沉默對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、活性氧簇(ROS)水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞MRC-5，并分為對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組和實驗組。陰性轉(zhuǎn)染組和實驗組分別通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA及設(shè)計好的3個Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)，培養(yǎng)48 h，real-time PCR法檢測Prx-1 mRNA，選取轉(zhuǎn)染Prx-1 siRNA-453的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。除對照組外，其余三組給予TGF-β1(5 μg/L)刺激。TGF-β1刺激24 h后，MTT實驗觀察細(xì)胞增殖情況，2,7-二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)實驗檢測ROS水平；TGF-β1刺激45min后，Western blotting法檢測p-AKT蛋白。結(jié)果對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗組OD值分別為0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18，ROS水平分別為2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；實驗組細(xì)胞增殖情況及ROS水平與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組與對照組相比，P均<0.01。對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗組細(xì)胞中p-AKT蛋白相對表達(dá)量分別為0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組與對照組相比，P<0.01。結(jié)論 Prx-1基因沉默可增強TGF-β1對肺成纖維細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)作用，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和p-AKT蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：肺成纖維細(xì)胞；硫氧還原蛋白過氧化物酶1；基因沉默；轉(zhuǎn)化生長因子β1；細(xì)胞增殖；活性氧簇；蛋白激酶B

肺成纖維細(xì)胞增殖是矽肺肺組織纖維化的重要原因之一，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)對肺成纖維細(xì)胞增殖有重要的促進(jìn)作用[1]。TGF-β1可上調(diào)活性氧簇(ROS)水平，并由此激活C-Jun蛋白激酶(JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)矽肺纖維化[2，3]。最近研究表明，ROS激活蛋白激酶B (AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖中也發(fā)揮重要作用[4，5]。硫氧還原蛋白過氧化物酶1(Prx-1)可快速有效清除ROS，并抑制ROS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活[6]。2015年1~7月，我們觀察了Prx-1基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、ROS水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達(dá)的影響，為Prx-1用于矽肺治療提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料人胚胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5，TGF-β1，兔抗人AKT抗體，兔抗人總AKT(T-AKT)和p-AKT抗體，兔抗人Prx-1抗體，Prx-1 siRNA及Prx-1上、下游引物，SYBR+Tap混合劑和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，MTT試劑盒，活性氧檢測試劑盒，酶聯(lián)免疫檢測儀，凝膠圖像分析儀。

1.2Prx-1基因沉默方法及Prx-1 mRNA檢測利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將預(yù)先設(shè)計好的3個Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。TRIzol提取細(xì)胞總RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μL cDNA進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR結(jié)果示3個Prx-1 siRNA不同程度地降低了Prx-1 mRNA表達(dá)水平，其中轉(zhuǎn)染Prx-1 siRNA-453者Prx-1表達(dá)水平最低，將Prx-1 siRNA-453用于后續(xù)實驗。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組MRC-5細(xì)胞接種于含5%血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。將MRC-5細(xì)胞分為四組，待MRC-5細(xì)胞融合至80%后開始實驗。對照組給予0.4%血清繼續(xù)培養(yǎng)；TGF-β1組給予0.4%血清培養(yǎng)12 h，使其同步化，然后給予TGF-β1(5 μg/L)刺激；陰性轉(zhuǎn)染組加入脂質(zhì)體Lipofectamine2000和陰性對照siRNA，孵育48 h后0.4%血清培養(yǎng)12 h，給予TGF-β1(5 μg/L)刺激；實驗組加入脂質(zhì)體Lipofectamine2000和Prx-1 siRNA-453，孵育48 h后0.4%血清培養(yǎng)12 h，給予TGF-β1(5 μg/L)刺激。

1.4MRC-5細(xì)胞增殖觀察TGF-β1刺激24 h后(對照組于同一時間)棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT 200 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄MTT，每孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩10 min，495 nm波長測定吸光度(OD)值，以O(shè)D值代表MRC-5細(xì)胞增殖情況。

1.5MRC-5細(xì)胞內(nèi)ROS檢測采用2,7-二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)實驗檢測ROS。各組細(xì)胞TGF-β1刺激24 h后用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，計數(shù)1×104個細(xì)胞，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm下測定細(xì)胞熒光強度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.6MRC-5細(xì)胞中p-AKT蛋白檢測采用Western blotting法。各組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激45 min后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌。每組加入200 μL新鮮配制的細(xì)胞裂解液，冰上震蕩裂解30 min，收集裂解細(xì)胞，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清，-70 ℃保存?zhèn)溆?。以考馬斯亮藍(lán)R-250染色測定蛋白濃度，以每孔20 μg上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，T-AKT和p-AKT一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，BCIP/NBT顯色3 min。用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描及定量分析。以p-AKT與T-AKT灰度值之比作為p-AKT相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖情況比較對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗組OD值分別為0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組與對照組相比，P均<0.01。

2.2各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗組ROS水平分別為2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組與對照組相比，P均<0.01。

2.3各組細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)比較對照組、TGF-β1組、陰性轉(zhuǎn)染組、實驗組細(xì)胞中p-AKT蛋白相對表達(dá)量分別為0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組與對照組相比，P<0.01。

3討論

ROS是細(xì)胞氧化系統(tǒng)中產(chǎn)生的含有活性氧功能基團(tuán)的化合物，包括氧自由基、過氧化物和激發(fā)態(tài)氧等。病理狀態(tài)下，過多ROS攻擊細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。ROS還參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作為TGF-β1等多種細(xì)胞因子的第二信使，調(diào)節(jié)ERK1/2、JNK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，介導(dǎo)細(xì)胞增殖[2，3]。最近研究顯示，ROS/AKT途徑參與了腫瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖[4，5]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)AKT被激活時，其第308位蘇氨酸和第473位絲氨酸發(fā)生磷酸化，并從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，激活或抑制下游靶蛋白，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等作用[8~10]。本研究實驗組在TGF-β1刺激24 h后，OD值較對照組增高，說明TGF-β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖；同時TGF-β1組ROS水平及p-AKT表達(dá)較對照組增高，提示ROS/AKT通路激活在TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，與Wang等[11]的研究結(jié)果一致。

Prx-1是一種新型過氧化物酶，有強大的抗氧化能力，其結(jié)構(gòu)中的過氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸是清除H2O2的主要功能基團(tuán)[12]。研究[13]顯示，Prx-1可通過降低ROS調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)活性。有學(xué)者[14]發(fā)現(xiàn)，Prx-1與NADPH氧化酶在人動脈粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞中表達(dá)位置相同，表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，認(rèn)為Prx-1不僅可在ROS產(chǎn)生的第一時間原位將其清除，而且對ROS敏感度高，是氧化應(yīng)激的“感受器” 。另外，Prx-1還可抑制ROS介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，如在β-拉帕醌(一種抗癌藥)誘導(dǎo)的人宮頸癌細(xì)胞凋亡過程中，凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)通過激活JNK途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Prx-1可通過促進(jìn)TRX與ASK1結(jié)合從而抑制ASK1活性和細(xì)胞凋亡[15]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Prx-1可下調(diào)ROS水平進(jìn)而抑制JNK和ERK1/2通路激活，緩解大鼠矽肺纖維化[2，3，16 ]。本實驗利用Prx-1 siRNA轉(zhuǎn)染肺成纖維細(xì)胞，沉默Prx-1基因表達(dá)，結(jié)果顯示肺成纖維細(xì)胞增殖增強，ROS水平升高，p-AKT蛋白表達(dá)上調(diào)，提示Prx-1基因沉默后，ROS水平升高、AKT通路激活，二者在TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，Prx-1基因沉默可進(jìn)一步增強TGF-β1對肺成纖維細(xì)胞的增殖誘導(dǎo)作用，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和p-AKT蛋白表達(dá)。

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Effects of silencing peroxiredoxin-1 gene on proliferation, ROS and p-AKT protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1

LIUBaoxin1,LIUYingyu,WEIZhongqiu,LIANGTingting,FANYulei,YANGFang,SUNYing

(1TangshanWorkers′HospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of silencing peroxiredoxin-1 (Prx-1) gene on the proliferation, reactive oxygen species (ROS) and phosphorylated AKT (p-AKT) protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1. Methods The cultured MRC-5 pulmonary fibroblasts were randomly divided into 4 groups: control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group. The Prx-1 siRNA 3 sequences of Prx-1 siRNA (Prx-1 siRNA-209, Prx-1 siRNA-289, Prx-1 siRNA-453) were transfected into the negative transfection group and experimental group by Lipofectamine2000, respectively. After culturing for 48 h, Prx-1 mRNA was detected by real-time PCR to evaluate transfection and Prx-1 siRNA-453 was selected to be used later. Except for the control group, the other three groups were co-cultured with TGF-β1 (5 μg/L). Cell proliferation was detected by MTT assay and reactive oxygen species (ROS) level was detected by DCFH-DA assay after 24 h of TGF-β1 stimulation. p-AKT expression was detected by Western blotting after 45 min of TGF-β1 stimulation. Results The OD was respectively 0.56±0.07, 0.81±0.10, 0.88±0.18 and 1.16±0.18 in the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group, and the levels of ROS were 2 922±291, 4 348±484, 4 660±375 and 5 415±436, respectively. Significant difference were found in the levels of ROS and OD between the experimental group and the other three groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group was 0.45±0.05, 0.60±0.07, 0.57±0.07 and 0.77±0.09, respectively. The expression of p-AKT in the experimental group was the highest in all groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the TGF-β1 group was higher than that of the control group (P<0.01). Conclusion Silencing Prx-1 gene can enhance the proliferation of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1, and up-regulate the level of ROS and p-AKT protein expression in the cells.

Key words:lung fibroblasts; peroxiredoxin; gene Silencing; transforming growth factro-β1; cell proliferation; reactive oxygen species; protein kinase B

(收稿日期：2015-11-08)

中圖分類號：R563.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.006

通信作者簡介：孫影(1976-)，女，博士，副教授，主要研究方向為矽肺的基礎(chǔ)研究。E-mail: 1565756268@qq.com

作者簡介：第一劉寶欣(1974-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向為慢阻肺的基礎(chǔ)和臨床。E-mail: syzxp@sina.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81072254)；唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展項目(14130275B)。