管一世

(成都體育學(xué)院 四川 成都 610041)

膜片鉗技術(shù)簡述

管一世

(成都體育學(xué)院 四川 成都 610041)

80年代初發(fā)展起來的膜片鉗技術(shù)(patchclamptechnique)為了解生物膜離子單通道的門控動力學(xué)特征及通透性、選擇性膜信息提供了最直接的手段。該技術(shù)的興起與應(yīng)用，使人們不僅對生物體的電現(xiàn)象和其他生命現(xiàn)象更進一步的了解，而且對于疾病和藥物作用的認(rèn)識也不斷的更新，同時還形成了許多病因?qū)W與藥理學(xué)方面的新觀點。

膜片鉗;細(xì)胞;膜電位;膜片構(gòu)型;通道

一、 膜片鉗技術(shù)的基本原理

用一個尖端直徑在1.5～3.0μm的玻璃微電極接觸細(xì)胞膜表面，通過負(fù)壓吸引使電極尖端與細(xì)胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接，此時電極尖端下的細(xì)胞膜小區(qū)域(膜片，patch)與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定(鉗制，Clamp)電位，對此膜片上的離子通道的離子電流進行監(jiān)測及記錄。

基本的儀器設(shè)備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標(biāo)本灌流槽、玻璃電極研磨器、膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細(xì)胞記錄的關(guān)鍵設(shè)備，具有高靈敏度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過單根電極對細(xì)胞或膜片進行鉗制的同時記錄離子流經(jīng)通道所產(chǎn)生的電流。膜片鉗放大器的核心部分是以運算放大器和反饋電阻構(gòu)成的電流-電壓(I-V)轉(zhuǎn)換器，運算放大器作為電壓控制器自動控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定的水平上。

二、 膜片鉗技術(shù)的幾種記錄形式

細(xì)胞吸附膜片(cell-attachedpatch) 將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細(xì)胞膜表面上，形成高阻封接，在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制，高分辨測量膜電流，稱為細(xì)胞貼附膜片。由于不破壞細(xì)胞的完整性，這種方式又稱為細(xì)胞膜上的膜片記錄。此時跨膜電位由玻管固定電位和細(xì)胞電位決定。因此，為測定膜片兩側(cè)的電位，需測定細(xì)胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動看，這種形式的膜片是極穩(wěn)定的，因細(xì)胞骨架及有關(guān)代謝過程是完整的，所受的干擾小。

內(nèi)面向外膜片(inside-outpatch) 高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細(xì)胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。此時膜片兩側(cè)的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位，膜電位等于玻管電位的負(fù)值。如放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的，則輸出將與膜電流(Im)的負(fù)值相等。

外面向外膜片(out-sidepatch) 高阻封接形成后，繼續(xù)以負(fù)壓抽吸，膜片破裂再將玻管慢慢地從細(xì)胞表面垂直地提起，斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層，此時高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。這種膜片形式應(yīng)測膜片電阻，并消除漏電流和電容電流。整個過程要當(dāng)心是否形成囊泡。如果浴槽保持地電位水平，膜電位即與玻管電位相等。如放大器是非反向的，放大器的輸出將與Im值相等。

全細(xì)胞記錄構(gòu)型(whole-cellrecording) 高阻封接形成后，繼續(xù)以負(fù)壓抽吸使電極管內(nèi)細(xì)胞膜破裂，電極胞內(nèi)液直接相通，而與浴槽液絕緣，這種形式稱為“全細(xì)胞”記錄。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄，或?qū)⒉９苓B到標(biāo)準(zhǔn)高阻微電極放大器上記錄。在電壓鉗條件下記錄到的大細(xì)胞全細(xì)胞電流可達(dá)nA級，全細(xì)胞鉗的串聯(lián)電阻(玻管和細(xì)胞內(nèi)部之間的電阻)應(yīng)當(dāng)補償。任何流經(jīng)膜的電流均流經(jīng)這一電阻，所引起的電壓降將使玻管電壓不同于細(xì)胞內(nèi)的真正電位。電流愈大，愈需對串聯(lián)電阻進行補償。全細(xì)胞鉗應(yīng)注意細(xì)胞必需合理的小到其電流能被放大器測到的范圍(25～50nA)。減少串聯(lián)電阻的方法是玻管尖要比單通道記錄大。

三、 膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用

1、膜片鉗在通道研究中的作用

用膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進一步計算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開放概率，還可以用以研究某些胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對離子通道開閉及通道電流的影響等。同時用于研究細(xì)胞信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分泌機制。結(jié)合分子克隆和定點突變技術(shù)，膜片鉗技術(shù)可用于離子通道分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系的研究。

2、與藥物有關(guān)的心肌離子通道

心肌細(xì)胞通過各種離子通道對膜電位和動作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來，國外學(xué)者在人類心肌細(xì)胞離子通道特性的研究中取得了許多進展，使得心肌藥理學(xué)實驗由動物細(xì)胞模型向人心肌細(xì)胞成為可能。

3、對離子通道生理與病理情況下作用機制的研究

通過對各種生理或病理情況下細(xì)胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機制。如對鈣離子在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損害中作用機制的研究表明，缺血性腦損害過程中，Ca2+ 介導(dǎo)現(xiàn)象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道開放，過多的Ca2+進入細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元及細(xì)胞膜損害，膜轉(zhuǎn)運功能障礙，嚴(yán)重的可使神經(jīng)元壞死。

4、對單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究

將膜片鉗技術(shù)與單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)欠磻?yīng)技術(shù)結(jié)合，在全細(xì)胞膜片鉗記錄下，將單細(xì)胞內(nèi)容物或整個細(xì)胞(包括細(xì)胞膜)吸入電極中，將細(xì)胞內(nèi)存在的各種mRNA全部快速逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)常規(guī)PCR擴增及待檢的特異mRNA的檢測，借此可對形態(tài)相似而電活動不同的結(jié)果做出分子水平的解釋或為單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供標(biāo)本，為同一結(jié)構(gòu)中形態(tài)非常相似但功能不同的事實提供分子水平的解釋。目前國際上掌握此技術(shù)的實驗室較少，我國北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所于1994年在國內(nèi)率先開展。

[1]馬二寶 楊占成 龔團蓮 高原 唐忠有 李樹光 《內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版》 2006 第6期

[2]李鵬云 曾曉榮 楊艷 蔡芳 《四川生理科學(xué)雜志》 2006 第2期

[3]劉振偉 李立君 劉傳繢 ：海馬腦片盲法膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)

[4]康華光 《中國醫(yī)療器械雜志》 2000 第3期：細(xì)胞電生理與膜片鉗技術(shù)

[5]尹曉明 賈莉君 范曉榮 沈其榮： 離子選擇微電極技術(shù)及其在植物營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

管一世(1992.03-)，男，漢族，吉林，碩士研究生在讀，成都體育學(xué)院，研究方向：運動訓(xùn)練足球。