張 晶，徐宏偉，曾國(guó)航，宋顯明，艾東旭， 李蓮瑞

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3. 塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

米氏硫胺素芽孢桿菌的分離及鑒定

張 晶1，徐宏偉1，曾國(guó)航1，宋顯明1，艾東旭1， 李蓮瑞2,3

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3. 塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

【目的】分離、純化土壤中的細(xì)菌，通過(guò)鑒定得到米氏硫胺素芽孢桿菌?！痉椒ā客ㄟ^(guò)生化鑒定、提取細(xì)菌基因組并進(jìn)行細(xì)菌16 s rDNA測(cè)序等方法鑒定?！窘Y(jié)果】此細(xì)菌生化鑒定結(jié)果符合《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的關(guān)于米氏硫胺素芽孢桿菌的生化鑒定，將細(xì)菌的16 s rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì),表明該細(xì)菌為米氏硫胺素芽孢桿菌?！窘Y(jié)論】分離、純化得到的細(xì)菌經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ群蟠_定是米氏硫胺素芽孢桿菌。

細(xì)菌分離；細(xì)菌鑒定； 16 s rDNA；米氏硫胺素芽孢桿菌

0 引 言

【研究意義】米氏硫胺素芽孢桿菌屬于硫胺素芽孢桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)胞，細(xì)胞寬度為0.5～1.0 μm，芽孢橢圓形，芽孢中生、近中生和亞端生，包囊稍膨大。能夠在常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，例如營(yíng)養(yǎng)瓊脂和酪朊大豆瓊脂[1]。該菌在1996年由Shida等分離并命名[2]。Hiroaki Takagi等[3]基于表型特征和分子雜交，將其35株Bacillusbrevis(短芽孢桿菌)菌種分為六個(gè)獨(dú)立的種群，這其中就包括Aneurinibacillusmigulanus。該菌能夠分解硫胺素[4]，在國(guó)內(nèi)的研究甚少，對(duì)該株細(xì)菌的進(jìn)一步的鑒定非常有必要。rRNA是核糖體的重要組成部分，也是RNA中含量最多的，達(dá)到80%以上。原核生物的核糖體RNA按照沉降系數(shù)分為三類，5、16和23 s。5 s rRNA的編碼基因(rDNA)最小150 bp左右，包含的遺傳信息有限，23 s rRNA的編碼基因(rDNA)為3 kb左右，太大，而16 s rRNA的編碼基因16 s rDNA的大小為1 500 bp左右，大小適中，且其包含了豐富的遺傳信息。16 s rDNA包含10個(gè)可變區(qū)和一個(gè)穩(wěn)定區(qū)，其中可變區(qū)具有種間特異性，恒定區(qū)則差異很小，故可以利用16s rDNA的這個(gè)特點(diǎn)來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定分類，一般不同菌屬16 s rDNA的序列一致性在70%～95%，大于95%便可以確定為同一個(gè)菌屬[5-6]。與此同時(shí)，大量微生物尤其是致病微生物的16 s rDNA的序列已經(jīng)被克隆，測(cè)序并被數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，為利用16 s rDNA法鑒定微生物奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Marina Berditsch[7]等AneurinibacillusmigulanusATCC9999菌株的菌落形態(tài)和產(chǎn)短桿菌肽能力的研究中，對(duì)AneurinibacillusmigulanusATCC9999的六種菌落形態(tài)做了具體描述，并對(duì)每種菌落形態(tài)下產(chǎn)抗菌素短桿菌肽的能力進(jìn)行了比較。同時(shí)證明Aneurinibacillusmigulanus能產(chǎn)生抗菌的短桿菌肽S，短桿菌肽S是10個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，其氨基酸組成為[FPVOLFPVOL]cyclo，短桿菌肽S具有很廣譜的抗菌活性，包括革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陰性菌，真菌，病毒和單真核細(xì)胞[8]。丁若垚等[9]利用米氏硫胺素芽孢桿菌DY3菌株漚麻制備紅麻纖維。陳艷玲[10]在EM菌中分離鑒定到一株硫胺素芽孢桿菌，該菌不僅能分解含硫物質(zhì)、含氮物質(zhì)，還能分解無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷，有效地增加土壤活性磷的含量，從而供植物吸收利用[11]；在陳艷玲的單一菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，硫胺素芽孢桿菌還有顯著地分解動(dòng)物蛋白的效果，適合水產(chǎn)品加工下腳料的發(fā)酵。利用16 s rDNA來(lái)鑒定微生物尤其是致病微生物的應(yīng)用是很多的，黃勁等[12]利用PCR擴(kuò)增16 s rRNA的保守區(qū)域成功鑒定出甲型副傷寒沙門菌細(xì)胞壁缺陷突變株；常洪濤等[13]通過(guò)16 s rRNA對(duì)河南淮南豬源副豬嗜血桿菌進(jìn)行鑒定；該法快速，準(zhǔn)確，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到微生物的鑒定中。Hua Zhou等[14]通過(guò)16 s rDNA序列分析鑒定普雷沃菌。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)該菌進(jìn)行生化鑒定，根據(jù)東秀珠、蔡妙英等的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步判定細(xì)菌種屬，利用16 s rDNA鑒定該菌，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)最終確定其種屬。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)米氏硫胺素芽孢桿菌的分離與鑒定、擴(kuò)增細(xì)菌16 s rDNA并送測(cè)序以確定菌種。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來(lái)源

新疆塔里木大學(xué)校園某試驗(yàn)站樓旁距地表20～80 cm土樣。

1.1.2 主要儀器、藥品

BCD-223GB型冰箱(科龍電器)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；CX31型生物顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)株式會(huì)社)；SW-CJ-KU型超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；DW-HW 328型-80℃冰箱(中科美菱低溫科技有限公司)；AUW220 SHIMADIU電子天平(日本島津電子天平)；Neofuge 15 R型超速冷凍離心機(jī)(Heal Force Development Ltd.力康發(fā)展有限公司)； ZHWY—200D全溫度振幅高速軌道搖床(上海智城)；Bio-metra的PCR儀；bio-rad凝膠成像系統(tǒng)；水浴鍋；紫外分光光度儀。

氫氧化鈉、0.4%酚紅溶液、氯化鈉(分析純)、葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、明膠、溴百里香酚藍(lán)、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、碘化鉀、甲基α-萘胺，5 mol/L 冰醋酸，對(duì)氨基苯磺酸，冰醋酸、對(duì)二甲基氨基苯甲醛，無(wú)水乙醇，濃鹽酸、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫銨、檸檬酸鈉、0.1% L-酪氨酸、液體石蠟、盧哥氏碘液、格里斯亞硝酸鹽試劑、Ehrlish試劑、尿素、醋酸、硫酸銨二甲苯、10%氯化鐵、氯化鈣、酵母膏、可溶性淀粉、過(guò)氧化氫均為國(guó)產(chǎn)；牛肉膏、牛肉浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸新霉素、多粘菌素、卡那霉素(生化試劑)、酵母粉均購(gòu)自sigma；基因組提取試劑盒購(gòu)自天根；凝膠回收試劑盒購(gòu)自全式金；PMD-18T購(gòu)自takara公司；PCR所用到的試劑。

1.1.3 試劑及配置(1)1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液

用電子天平稱取氫氧化鈉40.0 g溶于1 L蒸餾水中，待其冷卻至室溫后用1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行滴定檢驗(yàn)其濃度是否為1 mol/L。檢驗(yàn)后置于常溫下備用。

(2)0.4%酚紅溶液

稱取0.4 g酚紅置研缽中研碎，逐漸加入0.l mol/L 氫氧化鈉溶液1.28 mL,邊加邊研磨，使酚紅轉(zhuǎn)變成鈉鹽而溶于水中直到所有的顆粒完全溶解，然后倒入容量瓶中，定容至100 mL,濾紙過(guò)濾后棕色瓶4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)生理鹽水

用電子天平稱取0.9 g氯化鈉溶于100 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌20 min后常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)1%葡萄糖分離培養(yǎng)基

用電子天平分別稱取5.0 g氯化鈉、5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、10.0 g葡萄糖、20.0 g瓊脂置于1 L的燒杯內(nèi)加700 mL蒸餾水加熱使上述試劑溶解。將溶解后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.4～7.6后用蒸餾水定容到1 L，分裝。用121℃高壓滅菌20 min后放入4℃冰箱內(nèi)備用。

(5)1%葡萄糖增菌液

用電子天平分別稱取5.0 g氯化鈉、5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、10.0 g葡萄糖置于1 L的燒杯內(nèi)加700 mL蒸餾水加熱使上述試劑溶解。將溶解后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.4～7.6后用蒸餾水定容到1 L分裝。用121℃高壓滅菌20 min后放入4℃冰箱內(nèi)備用。

(6)50%卵黃鹽水

取鮮雞蛋一個(gè)，用醫(yī)用酒精對(duì)蛋殼表面進(jìn)行消毒。在無(wú)菌工作臺(tái)中將卵黃與卵蛋白分離開(kāi)來(lái)，用無(wú)菌醫(yī)用注射器吸出卵黃內(nèi)物質(zhì)按1∶1的比例溶于無(wú)菌的生理鹽水備用。

(7)EYA(卵黃瓊脂)培養(yǎng)基

用電子天平分別稱取40.0 g胰蛋白胨、2.0 g葡萄糖、5.0 g磷酸氫二鈉、20.0 g瓊脂、2.0 g氯化鈉、5.0 g硫酸鎂置于1 L的燒杯內(nèi)加700 mL蒸餾水加熱使上述試劑溶解。將溶解后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.4～7.6后用蒸餾水定容到1 L分裝。用121 ℃高壓滅菌20 min后放入恒溫水浴鍋內(nèi)，向內(nèi)加入50 %卵黃鹽水100 mL混勻后倒到平板上，倒好的平板于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(8)尿素鑒定培養(yǎng)基

用電子天平分別稱取0.50 g蛋白胨、0.05 g葡萄糖、0.25 g氯化鈉、0.10 g磷酸二氫鉀置于100 mL的燒杯內(nèi)加30 mL蒸餾水加熱使試劑溶解，再加入0.4 %酚紅0.15 mL混勻。將溶解混勻后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.2～7.4后用蒸餾水定容到50 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。放入55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，保溫30 min后，將20 %尿素溶液在無(wú)菌條件下用濾器過(guò)濾注入上述溶液混勻，每只試管分裝10 mL后制成斜面。

(9)明膠鑒定培養(yǎng)基

用電子天平稱取0.25 g蛋白胨、6.00 g明膠、0.15 g牛肉膏置于100 mL的燒杯內(nèi)加30 mL蒸餾水加熱使試劑溶解。將溶解混勻后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.2～7.4后用蒸餾水定容到50 mL，121℃高壓滅菌20 min。放入55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫30 min后在無(wú)菌條件下用濾器過(guò)濾注入上述溶液混勻，每只試管分裝10 mL后制斜面。

(10)糖鑒別培養(yǎng)基

用電子天平稱取3.4 g蛋白胨、1.5 g氯化鈉、0.03 g溴百里香酚藍(lán)至于500 mL的燒杯中加200 mL蒸餾水加熱溶解試劑。將溶解混勻后的溶液冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH 7.2～7.4后用蒸餾水定容至300 mL，在無(wú)菌條件下每只試管分別加入10 mL并向每種糖發(fā)酵管中加入相應(yīng)的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇各0.25 g。121℃高壓滅菌20 min制斜面，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(11)盧哥氏碘液

先在三角瓶中加入少量(10 mL)蒸餾水，加入10 g碘化鉀并用攪拌棒使之溶解。再加入5 g碘并攪拌一段時(shí)間使之完全溶解(不易溶解)，加蒸餾水定容至100 mL，裝試劑瓶常溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

(12)格里斯亞硝酸鹽試劑

甲液：甲基α-萘胺0.6 g，5 mol/L 冰醋酸100 mL，加熱溶解，4～10 ℃保存。

乙液：對(duì)氨基苯磺酸0.8 g，5 mol/L 冰醋酸100 mL，先用30 mL冰醋酸溶解對(duì)氨基苯磺酸，再加入冰醋酸至100 mL，4～10 ℃保存。

(13)Ehrlish試劑

對(duì)二甲基氨基苯甲醛1 g，無(wú)水乙醇95 mL，濃鹽酸20 mL混勻、溶解。

(14)硝酸鹽培養(yǎng)基

將1 g蛋白胨、0.1 g硝酸鉀、蒸餾水100 mL加入三角瓶中加熱、溶解，將溶解混勻后的溶液冷卻至室溫，用1 mol/L 的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)pH=7.4，并用蒸餾水定容到100 mL，121 ℃高壓滅菌15～20 min后，分裝試管，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(15)檸檬酸鹽利用

用電子天平稱0.1 g氯化鈉、0.02 g七水硫酸鎂、0.05 g磷酸二氫銨、0.2 g檸檬酸鈉、瓊脂2 g，量筒量取蒸餾水100 mL、0.04% 酚紅2 mL。以上成分除指示劑外其余加熱溶解，調(diào)節(jié)pH 6.8～7.0，并加入指示劑，使培養(yǎng)基呈枚紅色，121 ℃高壓滅菌20 min后，倒平板，凝固后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(16)淀粉水解

在三角瓶中加入0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g氯化鈉、0.2 g可溶性淀粉、蒸餾水100 mL，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，然后加入2 g瓊脂，定容至100 mL ，121 ℃高壓滅菌20 min后，倒平板，凝固后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(17)吲哚培養(yǎng)基

在三角瓶中加入1 g蛋白胨、0.5 g氯化鈉溶解，調(diào)pH=7.6，蒸餾水定容至100 mL，分裝1/3-1/4試管，121 ℃ 高壓滅菌20 min。Ehrlish試劑待使用。

(18)酪氨酸水解培養(yǎng)基

采用肉湯蛋白胨培養(yǎng)基加0.1% L-酪氨酸，調(diào)節(jié)pH=7.0，121℃ 高壓滅菌20 min，傾倒平板。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌分離

采樣：取新疆塔里木大學(xué)校園某試驗(yàn)站樓旁距地表20～80 cm土樣1 g。

富集培養(yǎng)：將1 g樣品于l mol/L明膠磷酸鹽緩沖液中，機(jī)械法均質(zhì)后，于75～80 ℃的水浴保溫15 min。以3 000 r/min離心5 min,然后加入50%乙醇1 mL，用渦旋混勻器將其混勻后作用20 min。再用3 000 /min離心5 min，去掉上液，用pH 7.0的磷酸緩沖液沖洗，反復(fù)作用3次。

分離培養(yǎng)：從富集增菌液中取出100 μL于1.5 mL的離心管中，加入900 μL的1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基做倍比稀釋。稀釋倍數(shù)為10、102、103、104倍，分別涂于1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下培養(yǎng)24 h。將倍比稀釋涂板長(zhǎng)出的單菌落用接種環(huán)刮下，用1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基稀釋后涂于含有10 g/mL硫酸新霉素平板上，37℃條件下培養(yǎng)24 h。將能夠在含有10 g/mL硫酸新霉素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落用接種環(huán)刮下，用1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基稀釋后涂于含有10 g/mL卡那霉素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上， 37℃條件下培養(yǎng)24 h。將能夠在含有10 g/mL卡那霉素平板上生長(zhǎng)的菌落用接種環(huán)刮下，用1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基稀釋后涂于含有100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下培養(yǎng)24 h。將能夠在含有100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落用接種環(huán)刮下，用1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基稀釋后涂于含有10 g/mL硫酸新霉素、卡那霉素和100 000 g/mL多粘菌素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下培養(yǎng)24 h。將能夠在10 μg/mL硫酸新霉素、卡那霉素和100 000 μg/mL多粘菌素1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落接種于EYA培養(yǎng)基上(卵黃瓊脂培養(yǎng)基)，37℃條件培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況。挑取單菌落進(jìn)行液體增菌培養(yǎng)。

制樣品稀釋液：取裝有無(wú)菌水900 μL的試管4支，編號(hào)10-1、10-2、10-3、10-4，進(jìn)行梯度稀釋。再?gòu)脑鼍褐形?00 μL菌液加入到編號(hào)10-1的試管中，混勻，制成1∶10濃度的懸液，移取100 μL 10-1管中液體于10-2管中混勻，然后移取100 μL 10-2管中土壤懸液于10-3管中混勻，直至稀釋到10-4管。

細(xì)菌保存：挑取最終分離得到的單菌落接種在含有3 mL普通液體培養(yǎng)基的試管中，置于ZHWY-200D全溫度振幅高速軌道搖床37℃、180 r/min培養(yǎng)6 h，試管中的液體培養(yǎng)基變渾濁。在菌種管中，加入500 μL的渾濁菌液，然后加入500 μL的甘油，渦旋振蕩30～60 s，封膜保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌的生化鑒定

地衣芽胞桿菌鑒定參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]的方法，對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

(1)菌體形態(tài)觀察

革蘭氏染色：用接種環(huán)從新鮮培養(yǎng)的菌落上挑取一環(huán)菌，對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色。染色后，在油鏡下鏡檢。若菌體呈藍(lán)紫色，則為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌；若菌體呈紅色，則為革蘭氏陰性細(xì)菌。

孔雀石綠染色：對(duì)芽孢進(jìn)行染色，染色后鏡檢，芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

(2) 菌落培養(yǎng)特征

在鑒別培養(yǎng)基—卵黃瓊脂培養(yǎng)基(EYA)上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄菌落的形狀、大小、突起、邊緣、粘稠性、顏色、光學(xué)特性及氣味等特征。

(3)糖(醇)代謝試驗(yàn)

采用細(xì)菌生化微量鑒定管進(jìn)行糖(醇)或糖昔發(fā)酵試驗(yàn)。選擇葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、七葉昔這六種糖(醇)或糖苷發(fā)酵培養(yǎng)基用于該試驗(yàn)。將待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，用接種環(huán)(或針)接種至被選用的糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，置適宜溫度培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至幾天(一般陽(yáng)性24～48 h出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，如為陰性時(shí)，繼續(xù)觀察3～4 d仍不出現(xiàn)反應(yīng))。待檢菌發(fā)酵所試驗(yàn)的糖(醇)或糖昔時(shí)，管內(nèi)的pH指示劑變色，陽(yáng)性反應(yīng)記為“+”，陰性反應(yīng)記為“-”。

(4) 尿素酶試驗(yàn)

濃密地涂布待檢菌新鮮純培養(yǎng)物在尿素瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)，于2～4及24 h各觀察一次結(jié)果。培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)，顏色不變色為陰性反應(yīng)，如為陰性可繼續(xù)培養(yǎng)觀察4 d。

(5)明膠液化試驗(yàn)

取待檢菌純培養(yǎng)物，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基管中，于37 ℃培養(yǎng)7 d，每天觀察結(jié)果。判定結(jié)果前，放冰箱10～20 min。如明膠呈現(xiàn)液體狀態(tài)為陽(yáng)性反應(yīng)，呈凝固狀態(tài)為陰性反應(yīng)。

(6) 硝酸鹽還原試驗(yàn)

待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～4 d。取試劑甲液與乙液，等量混合后加入培養(yǎng)液中，每5 mL培養(yǎng)液加入混合試劑0.1 mL后觀察結(jié)果，顯紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。

(7)檸檬酸鹽利用

無(wú)菌條件下將幼齡菌種涂布接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

(8) 淀粉水解

用接種環(huán)取少量的菌種涂布于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，取出后滴加少量的盧戈氏碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，觀察菌落周圍變化。

(9)卵黃卵磷脂酶試驗(yàn)

接種環(huán)取少量培養(yǎng)18～24 h的幼齡菌種涂布于卵黃卵磷脂酶平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落四周是否有不透明的區(qū)。

(10) 形成吲哚

將菌種接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，取出后加入二甲苯2～3 mL，搖勻靜置，沿試管壁緩慢加入Ehrlish試劑2 mL，靜置，觀察顏色變化。

(11)酪氨酸水解試驗(yàn)

用接種環(huán)挑取單菌落涂布于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7～14 d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。

(12)接觸酶

將培養(yǎng)24 h的斜面菌種，以鉑絲接種環(huán)取一小環(huán)涂抹于已滴有3%過(guò)氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。

1.2.3 細(xì)菌16 s rDNA的鑒定

1.2.3.1 總DNA的提取

米氏硫胺素芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，要借助溶菌酶的作用才能很好地破壞該菌的細(xì)胞壁，所以在提取基因組之前，先用20 mg/mL的溶菌酶37°C處理40 min，之后利用天根公司提供的DNA提取試劑盒，并按照試劑盒說(shuō)明書，提取米氏硫胺素芽孢桿菌的DNA。

1.2.3.2 16 s rDNA基因擴(kuò)增

選擇的引物為擴(kuò)增細(xì)菌的通用引物PF：5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3’和PR：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1 500 bp左右，PCR擴(kuò)增體系選用20 μL體系：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，PF 0.5 μL，PR 0.5 μL，模板 2 μL，TaqDNA聚合酶 0.4 μL，ddH2O 13 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性55 s，57℃退火55 s，72℃延伸55 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，結(jié)束循環(huán)后72℃再延伸10 min。

1.2.3.3 T載體的連接和轉(zhuǎn)化

切膠回收目的片段，檢測(cè)目的片段的濃度，將載體和目的片段按摩爾比為1∶3的比例混勻，加入solution I，16℃連接過(guò)夜，連好之后，將其加入100 L DH5α中，熱擊90 s，37℃活化1 h，接種于含100 g/mL氨芐抗生素的LB板上，倒置培養(yǎng)12～16 h。

1.2.3.4 挑取已鑒定的陽(yáng)性克隆送往北京金諾銳杰有限公司測(cè)序，并用NCBI/BLAST工具對(duì)序列進(jìn)行比，確定其具體的菌屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與形態(tài)分析

對(duì)增菌液分別用10倍、102倍、103倍、104倍稀釋處理涂布于1%葡萄糖皰肉固體培養(yǎng)基平板上。研究表明，隨著稀釋倍數(shù)的增大平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)減少，逐漸出現(xiàn)單菌落。圖1

圖1 增菌液做不同倍數(shù)稀釋處理得到的菌落

Fig.1 The different concentration of disposed enrichment solution

挑取平板上的菌落，做革蘭氏染色，油鏡鏡檢,待檢菌為粗大桿菌，兩側(cè)平行，兩端鈍圓，直桿，芽孢為卵圓形，位于次級(jí)端，革蘭氏染色陽(yáng)性?？兹甘G染色鏡檢后，芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。芽孢卵圓形，近中生，孢囊稍膨。圖2，圖3

圖2 革蘭氏染色油鏡鏡檢結(jié)果

Fig.2 Microscopic result by G-strain method

圖3 孔雀石綠染色鏡檢結(jié)果

Fig.3 Microscopic result by MalachiteGreen oxalate method

2.2 菌落的形態(tài)

米氏硫胺素芽孢桿菌在卵黃瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)顯示，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層[15]。圖4

圖4 EYA平板上的菌落形態(tài)

Fig.4 The colony pattern on EYA medium

2.3 生化鑒定

根據(jù)硫胺素芽孢桿菌的生理生化特性，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]，初步鑒定為硫胺素芽孢桿菌。表1

表1 米氏硫胺素芽孢桿菌的生化鑒定結(jié)果

Table 1 The Physiological and biochemical Characteristics results ofAneurinibacillusmigulanus

培養(yǎng)基實(shí)際結(jié)果理論結(jié)果幼齡培養(yǎng)物呈桿狀++芽孢形狀橢圓橢圓包囊膨大++硝酸鹽還原++接觸酶++產(chǎn)生：吲哚--淀粉++尿素--卵黃卵磷脂酶--利用：檸檬酸鹽利用++酪氨酸水解++發(fā)酵：葡萄糖++甘露醇--

注：“+”，陽(yáng)性，“-”陰性

糖(醇)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葡萄糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、七葉苷培養(yǎng)基管內(nèi)的pH指示劑變色，反應(yīng)為陽(yáng)性；而麥芽糖培養(yǎng)基、甘露醇培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基管內(nèi)的pH指示劑不變色，反應(yīng)為陰性。在明膠培養(yǎng)基明膠呈現(xiàn)固體狀態(tài)，為陰性反應(yīng)，在尿素培養(yǎng)基中培養(yǎng)基顏色無(wú)變化，為陰性反應(yīng)。在檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)中，適溫培養(yǎng)3～7 d后，培養(yǎng)基對(duì)光旋轉(zhuǎn)呈藍(lán)色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。將細(xì)菌接種到淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h后，滴加碘液，菌落周圍有不變色透明圈，淀粉水解呈陽(yáng)性；接種到卵黃卵磷脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,觀察菌落四周沒(méi)有渾濁環(huán)出現(xiàn)，表示卵磷脂未分解成脂肪，說(shuō)明分離純化的菌株中沒(méi)有卵磷脂酶；將菌接種到硝酸鹽還原為亞硝酸鹽培養(yǎng)基24 h后，滴加試劑后，30 s內(nèi)出現(xiàn)紅色，表明細(xì)菌能從硝酸鹽中提出氧將其還原為亞硝酸鹽。將菌接種到吲哚培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)24 h后，取出加入二甲苯和Ehrlish試劑,培養(yǎng)基不變色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。酪氨酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。將24 h培養(yǎng)的斜面菌種接種在已滴有3%過(guò)氧化氫的玻片上，有氣泡產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.4 細(xì)菌的16 s rDNA的鑒定結(jié)果

將測(cè)序所得到的序列去掉相關(guān)的載體序列后，得到米氏硫胺素芽孢桿菌的全長(zhǎng)16 s rDNA的序列信息。該菌株的16 s rDNA長(zhǎng)度為1 499 bp，將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸比對(duì)后，結(jié)果表明，該菌株與Aneurinibacillusmigulanus的16 s rDNA的相似性達(dá)到99%。根據(jù)上述結(jié)果，可以判定該菌株為Aneurinibacillusmigulanus。以下附上Aneurinibacillusmigulanu的16 s rDNA序列信息。圖3

圖3 菌株的16 s rDNA的全長(zhǎng)序列

Fig.3 Complete sequences of Aneurinibacillus migulanus 16 s rDNA

GGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGCCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTT

GCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGT

ACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCG

GCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGTTTTAAGGGATTC

GCGCACTCTCGCGAGTTGGCTGCCCGTTGTTCCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCA

GGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGC

AGTCTCCCTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTT

GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTC

ACCGCTGCTCCGAAGAGAGCTCCTATCTCTAGGAGGGTCAGCGGGATGTCAAGCCCTG

GTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCC

CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGC

GTTAGCTGCGGCACTGAGGATTGGAGTCCCCAACACCTAGCACTCAACGTTTACGGCG

TGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGT

TACAGGCCAGAGAGCCGCCTTCGCCACGGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACC

GCTACACGTGGAATTCCGCTCTCCTCTCCTGCACTCAAGCTTCCCAGTTTCAAGTGGCC

CTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACACCTGACTTAAGAAGCCGCCTGCGCGCGCTT

TACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG

TAGTTAGCCGGGGCTTTCTCGTTAGGTACCGTCAGACCGGGAGGTCATCCCGGCGGTT

CTTCCCTAACAACAGAACTTTACGATCCGAAAACCTTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTC

CGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG

CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCT

TGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTGTACGTGACC

AAAGGTCTTTCCCTTTCAGACCATGCGGTCTGAAAGAAGTATCCGGTATTAGCTCCGGT

TTCCCGGAGTTATCCCAGTCGTACAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCC

GCTAACCGCCGAAGAGCAAGCTCTTCATTGGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACG

CCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTC

3 討 論

目前，微生物的鑒定方法主要有生化和分子生物學(xué)的鑒定。生化鑒定作為一種最經(jīng)典、最普遍的鑒定方法而一直被使用，但是生化鑒定耗時(shí)很長(zhǎng)、耗費(fèi)也大，對(duì)于一些生理生化性質(zhì)很接近的微生物則無(wú)法進(jìn)行鑒定；且目前該數(shù)據(jù)庫(kù)也是有限的，并沒(méi)有涵蓋所有的微生物的生化反應(yīng)信息，也只能鑒定一些常見(jiàn)的微生物。硫胺素芽孢桿菌屬有解硫胺素硫胺素芽孢桿菌、米氏硫胺素芽孢桿菌、嗜熱氣硫胺素芽孢桿菌3種。實(shí)驗(yàn)前部分所做的生化鑒定只能鑒定出該菌屬于硫胺素芽孢桿菌屬，無(wú)法精確其種類。

利用分子生物學(xué)的方法則更加的快速，準(zhǔn)確，只需擴(kuò)增一段微生物特異的一段DNA，短時(shí)間內(nèi)就能給出結(jié)果，準(zhǔn)確率也比較高，這在醫(yī)療領(lǐng)域用的很多。16 s rDNA的高度保守性使其有細(xì)菌化石之稱，通過(guò)16 s rDNA的克隆和測(cè)序，可進(jìn)一步準(zhǔn)確判斷其菌屬。因此將分離純化細(xì)菌的16 s rDNA送去測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，確定該菌是米氏硫胺素芽孢桿菌；OSAMU SHIDA等[16]通過(guò)16 s rRNA序列分析也得出同樣結(jié)論。實(shí)驗(yàn)所用的引物為細(xì)菌專用的通用引物，加之PCR的假陽(yáng)性的存在，很容易在擴(kuò)增16 s rDNA的時(shí)候出現(xiàn)問(wèn)題，造成結(jié)果誤差。所以在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，對(duì)微生物的培養(yǎng)，單克隆的挑取，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件上進(jìn)行了嚴(yán)格把控和條件摸索，16 s rDNA的擴(kuò)增質(zhì)量是有保證的，同時(shí)設(shè)置了陰性對(duì)照，保證了基于16 s rDNA序列的分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

從土壤中分離、純化得到的單菌落經(jīng)革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，表明該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，并且孔雀石綠染色結(jié)果表明該菌有芽孢；通過(guò)卵黃瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、明膠培養(yǎng)基培養(yǎng)、糖(醇)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)等生化實(shí)驗(yàn)表明該菌為硫胺素芽孢桿菌屬；利用DNA提取試劑盒中的說(shuō)明書提取該菌基因組，并進(jìn)行16 s rDNA擴(kuò)增、送檢，并將送檢結(jié)果在NCBI/Blast比對(duì)序列，結(jié)果表明該菌是硫胺素芽孢桿菌屬中的米氏硫胺素芽孢桿菌。

References)

[1]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)教育出版社,2001：56-57.

DONG Xiu-zhu, CAI miao-ying. (2001).Thecommon'sManualofDeteminativeBacteriology[M]. Beijing: Science Education Press：56-57. ( in Chinese)

[2]韓延平.需氧芽孢桿菌分類學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2001,29(4):73-78.

HAN Yan-ping. (2001). Advances in classification of aerobic bacillus[J].ProgressinMicrobiologyandImmunology, 29(4): 73-78. ( in Chinese)

[3] Takagi, H. , Shida, O. , Kadowaki, K. , Komagata, K. , & Udaka, S.(1993). Characterization of Bacillus brevis with descriptions of Bacillus migulanus sp. nov., Bacillus choshinensis sp. nov., Bacillus parabrevis sp. nov., and Bacillus galactophilus sp. nov[J].IntJSystBacteriol, 43(2): 221-231.

[4]劉秀花.芽孢桿菌生物學(xué)及其應(yīng)用[M].開(kāi)封:河南大學(xué)出版社,2007：41.

LIU Xiu-hua. (2007).Bacillusbiologyanditsapplication[M]. Kaifeng: Henan University Press：41. ( in Chinese)

[5]劉佳文, 呂紅艷. 16 S rRNA基因序列在分枝桿菌分類鑒定的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè), 2001,22(5): 265-266，268.

LIU Jia-wen, LV Hong-yan. (2001). Progress in the 16S rRNA gene sequence classification and identification of mycobacteria[J]. Foreign Medical Sciences,ClinicalBiochemistryandLaboratoryScienceVolume, 22 (05): 265-266，268. ( in Chinese)

[6]楊霞, 陳陸, 王川慶,等. 16S rRNA基因序列分析技術(shù)在細(xì)菌分類中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008,36(2): 55-60.

YANG Xia, CHEN Lu, WANG Chuan-qing, et al.(2008). Advances in gene sequence analysis techniques applied in bacterial 16S rRNA Classification[J].NorthwestAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEd. ), 36(2): 55-60. ( in Chinese)

[7]Berditsch, M. , Afonin, S. , & Ulrich, A. (2007). Ulrich.The Ability of Aneurinibacillus migulanus (Bacillus brevis)To Produce the Antibiotic Gramicidin S Is Correlated with Phenotype Variation[J].AmericanSocietyforMicrobiology, 73(20):6，620-6，628.

[8]Mogi, T. , & Kita, K. (2009). Gramicidin S and polymyxins: the revival of cationic cyclic peptide antibiotics[J].CellMolLifeSci, 66(23):3，821-3，827.

[9] 丁若垚,張興群. 一種利用米氏硫胺素芽孢桿菌DY3菌株漚麻制備紅麻纖維的方法：中國(guó), 201410334155.9 [P]. 2014-07-14.

DING Ruo-yao, ZHANG Xing-qun. (2014).AuseAneurinibacillusmigulanusDY3strainrettingkenaffiberpreparationmethod[P]: China, 201410334155.9. 2014-07-14. ( in Chinese)

[10]陳艷玲. 一種EM菌的組成鑒定及應(yīng)用初探[D].舟山:浙江海洋學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文，2014.

CHEN Yan-ling. (2014). A EM bacteria constituting Identification and application[D]. Master Thesis.ZhejiangOceanUniversity,Zhoushan. ( in Chinese)

[11]梅汝鴻,徐維敏.植物微生態(tài)學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998：104-105.

MEI Ru-hong, XV Wei-mei. (1998).Plantmicro-ecology[M]. Beijing: China Agriculture Press：104-105. ( in Chinese)

[12]黃勁,王和. 用PCR擴(kuò)增16 S rRNA基因鑒定甲型副傷寒沙門菌細(xì)胞壁缺陷突變株[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006,31(4): 333-335.

HUANG Jin, WANG He. (2006). The Identification of Cell Wall Deficient Mutants of Salmonella paratyphi A with 16S rRNA Gene Amplified by PCR[J].JournalofGuiyangMedicalCollege, 31 (4): 333-335. ( in Chinese)

[13]常洪濤,劉慧敏,杜繼梅,等. 地方土豬源副豬嗜血桿菌16 S rRNA基因的分子鑒定及遺傳進(jìn)化分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2013,40(11):157-160.

CHANG Hong-tao, LIU Hui-mei, DU Ji-mei, et al. (2013). Molecular Identification and Genetic Evolution Analysis of Haemophilus parasuis 16S RNA Gene in Local Pig Origin[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 40 (11):157-160. ( in Chinese)

[14]Hua Zhou ,Yihong Shen ,Qian Shen , & Jianying Zhou (2015). Thoracic empyema caused by Prevotella spp. diagnosed using 16S rDNA sequence analysis[J].TheClinicalRespiratoryJournal, 9(1): 121-124.

[15]崔國(guó)權(quán)，楊超. 新編衛(wèi)生應(yīng)急事件預(yù)防控制技術(shù)[M].長(zhǎng)春:吉林人民出版社, 2009：94.

CUI Guo-quan, YANG Chao. (2009).Newsanitationemergenciespreventionandcontroltechnology[M]. Changchun: Jilin People Press：94. ( in Chinese)

[16]SHIDA, O. ,TAKAGI, H. ,KADOWAKI, K. , KOMAGATA, K.(1996). Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov[J].IntJSystBacteriol, 46(4):939-946.

Fund project:Supported by NSFC (30690277) and the Basic Science and Technology Application Program of XPCC (2007JC07)

Isolation and Identification ofAneurinibacillusmigulanus

ZHANG Jing1，XU Hong-wei1，ZENG Guo-hang1,SONG Xian-ming1,AI Dong-xu1,LI Lian-rui2,3

(1.CollegeofLifeScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China; 2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China;3.KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProductionandConstructionCorps,AlarXinjiang843300,China)

【Objective】 To isolate and purify bacteria in soil in the hope of obtainingAneurinibacillusmigulanusthrough the process of identification. 【Method】 By biochemical identification, extracting bacterial genome, sequencing 16 s rDNA of bacterial methods to identify the bacteria. 【Result】 This bacterial biochemical identification results were consistent with theoretical results of "berger bacteria identification manual" about biochemical identification ofAneurinibacillusmigulanus, and then bacterial 16 s rDNA sequencing results were compared on the NCBI. 【Conclusion】 Bacteria isolated and purified were determined to beAneurinibacillusmigulanusby comparison of the sequenced bacillus.

bacteria separation；bacteria identification；16 s rDNA；Aneurinibacillusmigulanus

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.008

2015-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30690277)；兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2007JC07)

張晶(1991-)，女，新疆奎屯人，研究生，研究方向?yàn)樾笄莶≡懊庖邔W(xué)，(E-mail)573722063@qq.com

李蓮瑞(1968 - )，女，新疆人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾笄莶≡懊庖邔W(xué)，(E -mail)lilianrui51@163.com

S188

A

1001-4330(2016)01-0059-09