李偉瀚 田珍珍 周鶴林 王宜美 徐 暢 張懷斌

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

納米二氧化硅粒子的制備及對BSA結(jié)構(gòu)的影響

李偉瀚 田珍珍 周鶴林 王宜美 徐 暢 張懷斌

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

在堿性條件下水解正硅酸乙酯(TEOS)制備納米二氧化硅(SiO2)粒子，并采用同步熒光光譜和紫外可見分光光度法探討了SiO2對牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，SiO2納米粒子對BSA的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生顯著的影響，這說明在實驗條件下，SiO2不會改變BSA分子的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。

二氧化硅；牛血清白蛋白；同步熒光光譜；紫外可見分光光度法

0 引言

納米二氧化硅具有良好的物理化學(xué)性能，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣大研究者的青睞，經(jīng)常被用作靶向藥物的載體[1-4]。二氧化硅在被廣泛應(yīng)用同時，其對人體及其環(huán)境的毒性效應(yīng)也日益受到人們的高度關(guān)注。例如：趙峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)納米SiO2顆粒可降低血管內(nèi)皮細胞活力，破壞細胞膜完整性，損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，最終發(fā)生細胞凋亡；納米粒子可以隨血液進入體內(nèi)的各個組織器官[6]，并可以引起大鼠肺、肝、心等器官不同程度的損傷[7]。這些研究主要集中在納米二氧化硅對細胞和活體動物的毒性方面，而在分子水平上研究二氧化硅對蛋白質(zhì)的毒性作用方面國內(nèi)鮮見報道[8]。蛋白質(zhì)是組成生物體的重要物質(zhì)，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)因與人血清白蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)常作為體外模型蛋白[9]。鑒于上述原因，本文制備出了二氧化硅納米粒子，探討了二氧化硅納米粒子對BSA結(jié)構(gòu)的影響，為二氧化硅在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和安全性評價方面提供一些參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯(TEOS)、氨水、異丙醇(IPA)、牛血清白蛋白(BSA)、pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液、無水乙醇等均為分析純，購自國藥集團；水為二次蒸餾水。用Tris-HCl緩沖溶液配制濃度為1.0×10-5mol/L的BSA溶液，4 ℃的冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

TG16-WS臺式高速離心機(上海儀器廠)，GL-2型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)，JEM-1400透射電子顯微鏡(日本株式會社)，55型Fourier紅外光譜儀(德國Bruker公司)，TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析儀器公司)，LS55熒光儀(美國, PerkinElemer公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米SiO2粒子的制備

參照文獻[10]，量取16.5 mL IPA，16 mL氨水，28 mL蒸餾水于圓底燒瓶中，磁力攪拌均勻，加入60 mL TEOS溶液(1%，v:v，TEOS/IPA)，攪拌20 min，然后緩慢滴加6.0 mL TEOS，攪拌反應(yīng)6 h，離心得到白色二氧化硅(SiO2)，分別用乙醇、蒸餾水洗滌3次，烘箱中50 ℃烘干備用。

稱取10.70 mg SiO2納米粒子研細，超聲分散到50 mL蒸餾水中。每次使用前都超聲分散均勻。

1.2.2 納米SiO2粒子與BSA相互作用的光譜測試

取3 mL BSA溶液于石英比色皿中，依次加入一定量的納米SiO2分散液，混合均勻，靜置5 min，設(shè)定激發(fā)和發(fā)射波長的差值分別為15 nm和60 nm，在220～320 nm范圍內(nèi)進行同步熒光測定。

將上述BSA與納米SiO2的混合溶液在200～400 nm范圍內(nèi)測定其紫外可見吸收光譜強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米SiO2粒子的表征

圖1是SiO2納米粒子的透射電鏡圖，制備的SiO2納米粒子呈球形均勻分布，表面光滑，直徑約為220 nm。

圖2是SiO2納米粒子的Fourier紅外光譜圖，圖中1 636 cm-1處的峰是納米二氧化硅表面羥基的特征峰，1 112、796和453 cm-1處的峰分別對應(yīng)于Si-O-Si鍵的反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動和彎曲振動的吸收峰，952 cm-1處的峰是Si-OH的伸縮振動峰[10-11]。

圖1 SiO2納米粒子的透射電鏡照片F(xiàn)igure 1 TEM image of SiO2 nanoparticles.

圖2 SiO2納米粒子的FTIR紅外光譜圖Figure 2 FTIR spectra of SiO2 nanoparticles.

2.2 納米SiO2粒子對BSA結(jié)構(gòu)的影響

BSA分子中因含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸發(fā)色團而具有熒光。同步熒光技術(shù)在分析BSA分子微環(huán)境的變化方面具有較高的靈敏性。同步熒光發(fā)射峰位置的改變可以反映發(fā)色團微環(huán)境極性的變化，進而判斷物質(zhì)對BSA結(jié)構(gòu)的影響[12-13]。圖3是BSA在不同濃度(SiO2濃度由上到下分別為：0、1.33、2.63、3.92、5.19、6.45×10-3mg/mL)納米SiO2分散體系中的同步熒光光譜圖，圖3A是色氨酸的同步熒光光譜圖，當SiO2與BSA相互作用時，色氨酸的同步熒光強度降低，發(fā)射峰位置略有移動，這說明在該實驗條件下SiO2對色氨酸的微環(huán)境有影響，但影響較??；圖3B酪氨酸的同步熒光光譜發(fā)射峰位置和強度均沒有明顯的變化，這說明SiO2納米粒子對酪氨酸的微環(huán)境沒有影響。通過分析得出，少量的SiO2納米粒子對BSA結(jié)構(gòu)中微環(huán)境的影響甚小。

圖3 BSA的同步熒光光譜圖 A：色氨酸殘基的同步熒光光譜；B：酪氨酸殘基的發(fā)射光譜Figure 3 Synchronous fluorescence spectra of BSA with SiO2 nanoparticles at 296 K. A and B:Synchronous fluorescence spectra of tryptophan and tyrosine residues.

紫外可見分光光度法可以揭示BSA結(jié)構(gòu)的變化。BSA有兩個吸收峰，在210 nm處的強吸收峰主要是BSA分子二級結(jié)構(gòu)的吸收峰，此處吸收峰的變化可以反映BSA二級結(jié)構(gòu)變化的情況；280 nm處的弱吸收峰主要是氨基酸殘基的吸收峰，此處吸收峰的變化主要反映發(fā)色團微環(huán)境的變化[14]。固定BSA的濃度，逐漸增加SiO2的濃度，獲得BSA紫外可見吸收光譜如圖4，通過圖4，可以清晰地觀察到，隨著SiO2的加入，在210 nm和280 nm附近的吸收峰位置和強度均沒有發(fā)生變化。說明SiO2粒子對BSA的二級結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。

圖4 SiO2納米粒子存在下BSA的紫外-可見光譜圖Figure 4 UV-Vis absorption spectra of BSA with SiO2 nanoparticles.

3 結(jié)論

在堿性條件下水解TEOS制備出了粒徑為220 nm的SiO2粒子，采用光譜法研究了SiO2納米粒子對BSA結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，實驗條件下少量的SiO2納米粒子對BSA結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，說明SiO2納米粒子具有很好的生物相容性。這為SiO2納米粒子的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了一定的安全保障。

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Preparation of Silica Nanoparticles and their Effects on the Structure of Bovine Serum Albumin

LI Weihan, TIAN Zhenzhen, ZHOU Helin, WANG Yimei, XU Chang, ZHANG Huaibin*

(PharmaceuticalCollege,BinzhouMedicalUniversity,Yantai,Shandong264003，China)

The silica (SiO2) nanoparticles were prepared via hydrolyzing ethyl orthosilicate (TEOS) in an alkaline medium. The impact of silica nanoparticles on the structure of bovine serum albumin (BSA) was studied using synchronous fluorescence spectroscopy and UV-vis absorption spectroscopy. The results showed that SiO2nanoparticles do not influence significantly the structure of BSA. This also showed that the conformation and microenvironment near the chromophores of BSA don't be changed under the experimental conditions.

silica; bovine serum albumin; synchronous fluorescence spectroscopy; UV-vis absorption spectroscopy

10.3969/j.issn.2095-1035.2016.01.019

2015-09-02

2015-12-03

山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J12LD55)；濱州醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(BY2013DKCX107，BY2014DKCX092)資助

李偉瀚，男，學(xué)生。

通信作者:張懷斌，男，講師，主要從事生物分析化學(xué)研究。E-mail: zhanghuaibinhua@163.com

O654.4；X131

A

2095-1035(2016)01-0073-03