劉永軍

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 215036）

DNA組裝技術(shù)的研究進(jìn)展

劉永軍

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 215036）

合成生物學(xué)具有巨大發(fā)展?jié)摿?，作為一門(mén)新興學(xué)科，它有效結(jié)合了科學(xué)與工程，在生物制藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、物質(zhì)能源等方面發(fā)揮了巨大的作用。而DNA組裝技術(shù)是合成生物學(xué)中的關(guān)鍵技術(shù)，DNA組裝技術(shù)研究進(jìn)展極大的限制了合成生物學(xué)的快速發(fā)展本文在簡(jiǎn)述合成生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)上，基于DNA組裝的基本理念，對(duì)主要DNA組裝技術(shù)發(fā)展情況及其在合成生物學(xué)發(fā)展中的意義及應(yīng)用進(jìn)行了研究，為DNA組裝技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展提供參考與借鑒。

合成生物學(xué) DNA 組裝技術(shù) 研究進(jìn)展

DNA組裝技術(shù)是實(shí)現(xiàn)合成生物學(xué)各種目標(biāo)的重要環(huán)節(jié)及關(guān)鍵性步驟。隨著基因合成技術(shù)的不斷發(fā)展，采用基因合成的成本也在不斷的降低，其可行性也得到了大幅度的提升，人們通過(guò)研究探索利用合成基因組合成細(xì)胞的期望也進(jìn)一步增加?，F(xiàn)階段，對(duì)于各國(guó)設(shè)計(jì)合成基因組的水平仍不能滿(mǎn)足我們對(duì)合成實(shí)用生物組件的需要。關(guān)于合成生物學(xué)的大量研究工作仍然停留在人工合成組合生物組件和模塊化建設(shè)階段。顯然，DNA組裝技術(shù)是限制合成生物技術(shù)快速發(fā)展關(guān)鍵環(huán)節(jié)。所以研究DNA組裝技術(shù)對(duì)合成生物學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。

1　合成生物學(xué)簡(jiǎn)介

法國(guó)物理化學(xué)家Stephane Leduc于1911年在《生命的機(jī)理》一書(shū)中首次提出合成生物學(xué)?！昂铣缮飳W(xué)”對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到了空前的影響，并帶來(lái)了前所未有的改變，因此被認(rèn)為是可以改變世界的十大新技術(shù)之一［1］?；诮?jīng)典基因工程和代謝工程，合成生物學(xué)對(duì)工程、電子、計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)等多學(xué)科的內(nèi)容進(jìn)行了整合，深化了人類(lèi)對(duì)人細(xì)胞機(jī)制、物種改變、控制神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和演化的認(rèn)知，還能對(duì)DNA進(jìn)行重新編程，實(shí)現(xiàn)一些特殊的生物功能［2］。

合成生物學(xué)是結(jié)合了科學(xué)與工程的的新領(lǐng)域。它由分子生物學(xué)、基因組學(xué)、信息技術(shù)和工程合并，產(chǎn)生一套新的工具和方法，并通過(guò)在需求人（目標(biāo)）的研究和應(yīng)用，合成生命功能的生物分子（組件、模塊或組件）、系統(tǒng)甚至細(xì)胞，采用“自上而下”集成系統(tǒng)的生物學(xué)分析研究策略，為生物學(xué)研究提供了一個(gè)“自下而上”的合成策略及正向工程方法。人們利用基本的生物學(xué)元件設(shè)計(jì)和構(gòu)建了基因開(kāi)關(guān)、振蕩器、放大器、邏輯門(mén)、計(jì)數(shù)器等合成器件，實(shí)現(xiàn)對(duì)生命系統(tǒng)的重新編程并執(zhí)行特殊功能。

2　DNA組裝技術(shù)

DNA組裝的基本思想是將兩個(gè)分子凝聚銜接和片段組裝方式。DNA分子的鏈接內(nèi)，如同磚堆積成房子。由此可知，狹義上的“分子水泥”就是DNA連接酶，而廣義上是指創(chuàng)建兩個(gè)分子之間的重疊區(qū)域，通過(guò)連接或聚合。

Khorana等早在上世紀(jì)六七十年底就研究了寡核苷酸合成技術(shù)，這一舉動(dòng)為基因在化學(xué)界的打下了基礎(chǔ)。1970年，Khorana等［3］通過(guò)酵母丙氨酸t(yī)RNA基因編碼的合成，實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)歷史上第一次通過(guò)人工對(duì)基因進(jìn)行合成。然后，大量的蛋白質(zhì)編碼基因以大腸桿菌為載體實(shí)現(xiàn)了合成。早期的研究表明：化學(xué)合成基因的有效性和實(shí)用性是可以得到充分肯定的。在1980年代中期，研究出了超過(guò)100bp的寡核苷酸，這一研究極大的推動(dòng)了基因合成技術(shù)的發(fā)展及進(jìn)步。通過(guò)采用連接酶介導(dǎo)法、FokI法等，寡核苷酸被組裝成具有功能的基因。但是，早期的合成技術(shù)仍然存在著只能合成小于1 kb的DNA片段的不足。

基于兩步PCR，Kodumal通過(guò)使用該DNA合成法，合成了大量具有重疊區(qū)域的寡核苷酸基因。采用合成寡核苷酸基因的方法包括兩個(gè)鏈，所有的寡核苷酸重疊在PCR反應(yīng)體系反應(yīng)時(shí)，采用寡核苷酸片段作為鏈，通過(guò)擴(kuò)增長(zhǎng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)合成基因。

功能基因主要由三部分組成，包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）啟動(dòng)子、開(kāi)放閱讀框（ORF）和終止子。當(dāng)然還包括一些其他元素，如處在上游、下游的調(diào)整區(qū)域、RNA折疊區(qū)等等，可是這些元素都不是功能基因所必須具備的。將這些獨(dú)立的元素結(jié)合到一個(gè)功能基因是需要進(jìn)行排序的，首先是啟動(dòng)子ORF，然后是終止子ORF。BioBrickTM組裝法正式由Knight發(fā)明的一種有效的方法。在序列兩端加入單個(gè)元素可以有效的低成本，簡(jiǎn)單和采用固定模式的酶切連接方法將所有元素綜合到一個(gè)系統(tǒng)中去。通過(guò)BioBrickTM方法構(gòu)建的生物模塊，能夠在各個(gè)地方通用，實(shí)現(xiàn)資源共享。在過(guò)去的十年里，這種方法對(duì)提升合成生物學(xué)構(gòu)建生物組件起到了巨大的推動(dòng)作用。

作為合成生物學(xué)的最基礎(chǔ)部分，實(shí)現(xiàn)功能基因的成功組裝仍然是最基礎(chǔ)的步驟，目前主要的研究多集中在對(duì)若干個(gè)基因組的順序?qū)嶒?yàn)，以實(shí)現(xiàn)具有特殊功能的生物基因。例如，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)—通過(guò)iGEM項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)，生物燃油的生產(chǎn)—采用代謝工程等。在建立生物途徑的過(guò)程中，存在于基因之間的序列痕跡是不會(huì)對(duì)基因的功能的效用產(chǎn)生明顯的影響的。因此，BioBrickTM組裝方法是非常適用于基因組裝成的。但由于該方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，存在序列限制的缺點(diǎn)，因此只適合小規(guī)模途徑的建立。

3　總結(jié)與展望

DNA 組裝技術(shù)正處在一個(gè)快速發(fā)展階段，不同尺度的DNA組裝方法都會(huì)相繼誕生，這些方法均有各自的優(yōu)點(diǎn)，但從目前的研究結(jié)果來(lái)看，還沒(méi)有一個(gè)普遍性實(shí)用的組裝方法可以滿(mǎn)足序列依賴(lài)、無(wú)痕或標(biāo)志跟蹤不受序列位置的影響效果的實(shí)現(xiàn)，在這個(gè)過(guò)程中我們需要根據(jù)預(yù)設(shè)的順序快速并行裝配，并使用在大規(guī)模的合成基因組中。我們可以通過(guò)幾項(xiàng)技術(shù)串聯(lián)使用，充分利用不同的組裝技術(shù)有不同的適用特性這一特征。DNA合成將會(huì)更加快速、高效而廉價(jià)。大規(guī)模的基因、基因組的合成將成為現(xiàn)實(shí)。DNA 組裝技術(shù)的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛，促進(jìn)合成生物學(xué)的快速發(fā)展。

［1］ Huang G T.10 emerging technologies that will change your world ［J］.Technology Review，2004，107（1）：32-50.

［2］ Singh V.Recent advancements in synthetic biology：current statusand challenges［J］.Gene，2014，535（1）：1-11.

［3］ Itakura K，Hirose T，Crea R，et al.Expression inEscherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.Science，1977，198（4321）：1056-63.

Q-3

A

1674-2060（2016）05-0342-01