韓瑞玲，李艷

腦卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷臨床療效研究

韓瑞玲，李艷

目的：探討武漢地區(qū)部分腦卒中患者氯吡格雷代謝相關(guān)CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷臨床療效的關(guān)系。方法：選取武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的腦卒中患者292例，采用光比濁法檢測患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率，計算其血小板抑制率；采用基因芯片法測定患者的CYP2C19基因（*1，*2和*3），并將患者按照基因檢測結(jié)果分為不同代謝類型：快代謝型（*1/*1），中間代謝型（*1/*2和*1/*3）及慢代謝型（*2/ *2，*2/*3和*3/*3）。采用統(tǒng)計學(xué)方法分析CYP2C19不同代謝類型患者血小板抑制率的差異。結(jié)果：根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行代謝分型，快代謝型占37.33%，中間代謝型占46.92%，慢代謝型占15.75%。3種代謝類型患者服用氯吡格雷前后的血小板抑制率分別為（54.39±18.93）%，（30.02±21.53）%及（10.34± 3.83）%，3種代謝型患者之間血小板抑制率比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中快代謝型患者顯著高于中間代謝型和慢代謝型患者（P<0.05）。結(jié)論：腦卒中患者中CYP2C19*2、*3基因變異者使用氯吡格雷抗凝的療效較差，測定CYP2C19基因型對于腦卒中患者使用氯吡格雷治療可能具有重要的指導(dǎo)意義。

腦卒中；CYP2C19基因；基因多態(tài)性；氯吡格雷；血小板抑制率

新型抗血小板藥物氯吡格雷與阿司匹林的聯(lián)合應(yīng)用已成為中國腦血管病專家共同推薦的抗栓治療的首選藥物，廣泛應(yīng)用于急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke, AIS）患者[1]。氯吡格雷必須在體內(nèi)經(jīng)過以CYP2C19為主的肝臟細(xì)胞色素P450酶同工酶家族代謝成為活性產(chǎn)物，才能有效拮抗二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受體，抑制ADP對血小板的誘導(dǎo)作用，抗血小板聚集[2]。但部分患者對氯吡格雷存在低反應(yīng)或無反應(yīng)性，長期服用常規(guī)劑量的氯吡格雷（75 mg）仍不能有效抑制血小板聚集，此現(xiàn)象稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）[3]。本研究旨在通過分析腦卒中患者CYP2C19基因型與血小板抑制率之間的關(guān)系，探討CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷臨床療效的關(guān)系，并為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年6月至2015年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院，診斷為缺血性腦卒中、擬進(jìn)行血管內(nèi)治療并以氯吡格雷治療的湖北籍無血緣關(guān)系的患者292例，男性153例，女性139例；年齡39～81歲，平均（61.1±12.59）歲；病程8～75 h，平均（27.3±15.9）h；所有患者均為漢族，均否認(rèn)家族遺傳病病史。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次發(fā)??；符合2014年中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會修訂的中國急性缺血性腦卒中診治指南規(guī)定[4]，并通過CT或MRI證實(shí)；美國國立衛(wèi)生院腦卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分≥3分；采用雙聯(lián)抗血小板療法，首次負(fù)荷劑量口服阿司匹林及氯吡格雷均為300 mg/d，后改為阿司匹林100 mg/d，氯吡格雷75 mg/d，且口服氯吡格雷75 mg≥7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心功能不全者；嚴(yán)重肝腎功能損害者；患有內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病者；近期有出血史或者肝素誘發(fā)血小板減少患者；合并使用地西泮、奧美拉唑質(zhì)子泵抑制劑等經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物者。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 BR-526-24全自動雜交儀、BE2.0生物芯片識讀儀，購于上海百傲科技有限公司；T100 PCR儀購于美國Bio-rad公司，PACKS-4四通道血小板聚集及基質(zhì)分析儀購于美國Helena公司。全血基因組DNA提取試劑盒、CYP2C19基因檢測DNA微陣列芯片法試劑盒購于上海百傲科技有限公司、ADP購于美國Helena公司。

1.2.1 血小板聚集抑制率分析 所有研究對象在雙重抗血小板治療前和治療7 d后采集靜脈血4～5 mL（枸櫞酸鈉抗凝），采用光學(xué)比濁法測定5 μmol/LADP誘導(dǎo)的血小板聚集率。采用HemoRAM分析系統(tǒng)計算血小板聚集率。血小板聚集抑制率%=（治療前血小板聚集率-治療后血小板聚集率）/治療前血小板聚集率× 100%。血小板聚集抑制率＞10%被認(rèn)為對氯吡格雷敏感，血小板聚集抑制率≤10%時被認(rèn)為氯吡格雷反應(yīng)低下，即氯吡格雷抵抗[5]。

1.2.2 CYP2C19基因分型檢測[6]患者于血管內(nèi)治療前靜脈采血1～2 mL（EDTA管抽取，4℃存放），按照試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取和純化及PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物在BR-526-24全自動雜交儀上進(jìn)行雜交及顯色。采用BE2.0生物芯片識讀儀及V2.0基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析，分別檢測CYP2C19的636G、636A、681G、681A等位基因。根據(jù)分型檢測結(jié)果，將CYP2C19野生純合子*1/*1（636GG/ 681GG）定義為快代謝型（正常代謝型），單突變型1/*2和*1/*3定義為中間代謝型，純合子突變型*2/*2（636GG/681AA）、*3/*3（636AA/681GG）及雜合子雙突變型*2/*3（636GA/681GA）定義為慢代謝型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（χ±s）表示，正態(tài)分布樣本組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；Hardy-Weinberg平衡定律計算各等位基因頻率分布數(shù)據(jù)的可靠性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各等位基因的頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.076，P=0.781），提示被測群體基因遺傳平衡。CYP2C19基因型采用生物芯片法判讀并分類，本組患者中間代謝型比例略高于快代謝型，見表1。服用氯吡格雷后，快、中代謝型組血小板抑制率顯著高于慢代謝型組（P＜0.05），快代謝型組顯著高于中代謝型組（P＜0.05），見表2?？齑x型組血小板抑制率的分布與慢代謝型組相比具有顯著性差異（χ2=5.04，P=0.025），而與中間代謝型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=0.69，P= 0.406）。

表1 本組腦卒中患者CYP2C19基因型分布

表2 本組不同代謝型腦卒中患者血小板抑制率及分布[n(%)]

3 討論

噻吩吡啶類衍生物氯吡格雷在血管性疾病中抗血小板聚集的重要輔助治療作用已得到證實(shí)。國內(nèi)外研究表明，編碼氯吡格雷代謝相關(guān)CYP2C19酶的等位基因主要是*1，*2和*3型，其中*2和*3變異也稱缺失功能等位基因（loss-of-function alleles，LOF alleles），會導(dǎo)致氯吡格雷抵抗，使CYP2C19酶催化活性降低，氯吡格雷代謝減弱，從而導(dǎo)致其抗血小板作用減弱，影響氯吡格雷的療效及安全性[7,8]。其中*2位點(diǎn)突變所導(dǎo)致的缺血缺氧性心腦血管事件或1年內(nèi)死亡率的風(fēng)險比高達(dá)2.42[9,10]。

本研究將受試患者按照CYP2C19基因型別分為快、中、慢代謝型3組，結(jié)果顯示，擬行血管內(nèi)治療的腦卒中患者的CYP2C19基因多態(tài)性分布中，具有多態(tài)性的中間代謝型和慢代謝型占62.7%，這與國內(nèi)外相關(guān)報道的亞洲人群約50%～60%突變率相似[11-13]。但本研究各代謝型的分布與報道略有不同，表現(xiàn)為中間代謝型略高、弱代謝型略低，這些差異與研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)、遺傳背景及研究例數(shù)等的差異有關(guān)，亦提示我們需要進(jìn)行更大樣本的抽樣研究，建立更為科學(xué)的統(tǒng)計分析方法，從多因素，如年齡、性別、體重、吸煙史及其他病史（糖尿病、高血壓、高脂血癥、心絞痛等）、合并用藥（β-受體阻滯劑類、他汀類）等進(jìn)行綜合分析，才能取得更有參考價值的臨床資料。此外，本研究中不同代謝類型的腦卒中患者之間血小板抑制率具有顯著性差異，攜帶有1個或2個*2或/和*3基因的中間代謝型和慢代謝型患者，該基因編碼的CYP2C19酶的代謝功能降低，導(dǎo)致氯吡格雷代謝活性降低，血小板抑制率均顯著性低于無突變基因的快代謝型患者，提示*2和*3變異將導(dǎo)致氯吡格雷臨床療效降低，這與其他文獻(xiàn)報道相符[14-16]。根據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，血小板抑制率＜10%時患者對氯吡格雷不敏感，抗血小板聚集效果不佳，會導(dǎo)致血栓事件。本研究中，慢代謝患者血小板抑制率＜10%者占58.7%，與快代謝組相比具有顯著性差異，提示CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗存在關(guān)聯(lián)。

總之，本研究表明武漢地區(qū)部分腦卒中患者中CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的臨床療效具有一定相關(guān)性，CYP2C19*2、*3基因變異者使用氯吡格雷抗凝的療效較差，臨床醫(yī)務(wù)工作者可根據(jù)患者的CYP2C19基因型調(diào)整氯吡格雷用藥劑量或更換為其他抗血小板藥物，以達(dá)到優(yōu)化個體化用藥的目的，改善患者的預(yù)后。

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（本文編輯：唐穎馨）

Study on the CYP2C19 Gene Polymorphism and Clinical Efficacy of Clopidogrel in Patients with Stroke

HANRui-ling,LIYan.Department ofClinical Laboratory,RenminHospital ofWuhanUniversity,Wuhan,430060，China

Objective:To screen for the relationship between clopidogrel metabolism related gene CYP2C19 polymorphism and clinical efficacy of clopidogrel in patients with stroke.Methods:Two hundred and ninety-two patients with stroke treated with clopidogrel,hospitalized in the department of neurology of Renmin hospital of Wuhan university were selected as research objects.The platelet aggregation in patients before and after clopidogrel treatment was measured by optical aggregometry method in order to calculate the platelet inhibition rate. CYP2C19 genotypes(*l,*2,*3)were detected by gene chip method.According to the genotypes,all patients were divided into three different types of metabolism:fast metabolizer type(*1/*1),intermediate metabolizer types(*1/*2,*1/*3)and slow metabolizer types(*2/*2,*3/*3,*2/*3).The differences of platelet inhibition rates were analyzed by statistical methods among different types of metabolisms.Results:According to the classification of CYP2C19 gene polymorphism of metabolic function,patients of fast metabolism type accounted for 37.33%,while patients of intermediary metabolism type and slow metabolism type accounted of 46.92%and 15.75%,respectively.The platelet inhibition rate of the three metabolic types was（54.39±18.93）%,（30.02± 21.53）%and（10.34±3.83）%,respectively.There was statistical significance among the three metabolic types, and platelet inhibition rate of fast metabolic patients was significantly higher than intermediate metabolic and poor metabolic patients(P<0.05).Conclusion:The clinic therapeutic effect of clopidogrel in patients with*2 and *3 polymorphism was poor.Genotyping of CYP2C19 could be helpful in guiding individualized medication of clopidogrel in patients with stroke.

stroke;CYP2C19 gene;gene polymorphism;clopidogrel;platelet inhibition rate

R741;R741.05;R743

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.004

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科武漢 430060

國家自然科學(xué)基金（No.81501427）

2016-03-25

李艷yanlitf1120@163. com