李巷，潘建青，康慧聰，楊志剛，韓金玲，聶荔，肖小華，張玲玲，朱遂強

p-JNK/p-c-Jun通路參與大鼠杏仁核點燃癲癇模型

李巷1，潘建青1，康慧聰2，楊志剛1，韓金玲1，聶荔1，肖小華3，張玲玲1，朱遂強2

目的：研究杏仁核點燃癲癇模型中c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路的活化。方法：雄性Wistar大鼠20只，隨機分為對照組10只和模型組10只。將電極植入大鼠右側(cè)杏仁核，對照組不給予電刺激，模型組每天給予500 μA的電流刺激，大鼠連續(xù)10 d在刺激后達到5級發(fā)作視為點燃成功。成功點燃的大鼠，在最后1次5級發(fā)作后2 h處死。Western blot檢測2組海馬JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun的表達。結(jié)果：模型組刺激側(cè)海馬p-JNK、p-c-Jun表達明顯高于對照組（P＜0.05）。結(jié)論：p-JNK/p-c-Jun通路可能參與杏仁核癲癇模型點燃。

杏仁核點燃；磷酸化JNK；磷酸化c-Jun

顳葉癲癇及其動物模型主要的病理變化是海馬硬化，包括神經(jīng)元缺失及膠質(zhì)細胞增生[1]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK），是絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)成員之一，參與細胞生長、分化等的調(diào)控。JNK激活參與多種癲癇動物模型，與神經(jīng)元凋亡相關(guān)。JNK可通過一系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)激活?；罨腏NK可調(diào)控細胞核底物如c-jun等，促進細胞凋亡[2]。杏仁核點燃模型是目前國際公認的一種更為接近人類、應(yīng)用廣泛的復(fù)雜部分性發(fā)作模型。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，杏仁核點燃模型中刺激側(cè)海馬免疫組化染色有p-JNK表達，并與神經(jīng)元損害部位一致。本研究定量檢測刺激側(cè)海馬JNK/p-JNK及其下游信號c-jun/p-c-jun的表達，進一步闡述點燃模型海馬損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g。標(biāo)準(zhǔn)實驗條件飼養(yǎng)。1.1.2主要試劑 兔抗JNK多克隆抗體及兔抗p-JNK多克隆抗體購自美國Cell Signal公司，小鼠抗p-c-Jun多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分組6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立體定位儀上，將自制五芯電極中的刺激電極植入右側(cè)杏仁核基底外側(cè)核（前囟后2.2 mm,旁開右側(cè)4.8 mm，顱骨表面下8.5 mm）[4]。其他3個電極分別接上微型螺絲，置于前囟點左右及人字縫后方作為記錄電極和參考電極。牙托粉固定。將所有大鼠隨機分為對照組和模型組，各10只。2組均手術(shù)植入電極，術(shù)后1周，對照組每天抓取，但不予電刺激；模型組每天同一時間予電刺激：細電流，連續(xù)串刺激，延時100 ms，波寬1 ms，波間隔19 ms，頻率50 Hz，串長100，方波，刺激強度500 μA，1次/d。刺激后記錄大鼠行為學(xué)變化。發(fā)作強度參照國際通用的Racine分級，并參考以往研究[3]。連續(xù)10天達到5級發(fā)作視為模型點燃。最后1次5級發(fā)作2 h取標(biāo)本。

1.2.2 Western blot檢測 提取海馬組織蛋白，測定蛋白濃度后，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗、二抗孵育，DAB顯色，掃描膠片，使用美國Gene Genius公司凝膠成像分析系統(tǒng)分析JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun及β-actin光密度值。

1.2.3 組織學(xué)變化 制備腦組織冰凍切片，尼氏染色后中性樹膠封片，鏡下觀察電極位置是否正確，有無異常出血及組織損害。有以上情況出現(xiàn)的大鼠實驗數(shù)據(jù)予以剔除。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（χ±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Westernblot結(jié)果顯示，2組p-JNK46/54均有表達，模型組蛋白表達量明顯增多；相對光密度值分析示：對照組、模型組中p-JNK46/actin分別為（0.24±0.02）、（0.48±0.01），p-JNK54/actin分別為（0.26±0.02）、（0.50± 0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B；JNK在2組中均有大量表達，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。p-c-Jun在2組均有表達，相對光密度值分析示：對照組、模型組中p-c-Jun分別為（0.38±0.03）、（0.88±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B；c-Jun在2組中均有大量表達，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

模型組1只大鼠點燃不成功，電極脫落，其他大鼠點燃后均表現(xiàn)出穩(wěn)定的5級發(fā)作。對照組大鼠無電極脫落。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在成功點燃的模型中，刺激側(cè)海馬p-JNK表達明顯增多，與前期研究海馬神經(jīng)元損傷部位基本一致；刺激側(cè)海馬p-c-Jun表達明顯增多；提示杏仁核點燃模型可能是通過p-JNK激活c-Jun致p-c-Jun表達增多，參與海馬神經(jīng)元損傷。

圖1 對照組與模型組JNK與p-JNK變化

圖2 對照組與模型組c-jun與p-c-jun變化

JNK的編碼基因有3個，JNK1/2廣泛存在于體內(nèi)各種組織，JNK3主要分布在腦組織[4]，通過磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基來活化。各種促炎反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β，細胞應(yīng)激如熱休克、紫外線照射、氧化應(yīng)激都可以激活JNK[5]。JNK激活參與了多種癲癇動物模型，在毛果蕓香堿導(dǎo)致的癲癇持續(xù)狀態(tài)早期即有JNK的激活，且廣泛分布于邊緣系統(tǒng)，與神經(jīng)元損傷區(qū)域分布一致[6]；海人酸癲癇大鼠模型中，注射海人酸30 min即開始出現(xiàn)JNK激活，持續(xù)2 h恢復(fù)正常，同時JNK的底物c-jun磷酸化增強，參與神經(jīng)元損傷[7]。JNK1及c-jun活化參與電休克驚厥[8]；戊四氮小鼠癲癇模型中磷酸化JNK、磷酸化c-jun及上游信號MKK4均表達增多[9]。海馬快速電點燃模型中，膠質(zhì)細胞介導(dǎo)了JNK的活化并參與神經(jīng)元的損傷過程[10]。上述實驗均證實了JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了急性癲癇發(fā)作及神經(jīng)元損傷，但對于長期癲癇發(fā)作JNK通路是否參與研究較少。本實驗中，杏仁核低強度電流刺激點燃模型是一個長期慢性的過程，大鼠完全點燃持續(xù)15～20 d，與對照組相比，模型組刺激側(cè)海馬p-JNK及p-c-Jun表達明顯增多，與其他癲癇模型報道一致。

JNK活化后主要通過2個途徑參與細胞損傷：一方面，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子c-jun，進而增加AP-1轉(zhuǎn)錄及細胞凋亡；另一方面，一部分激活的JNK留在胞質(zhì)中，參與Bcl-2家族成員的活化，最終導(dǎo)致細胞凋亡。本實驗中刺激側(cè)海馬p-JNK及p-c-Jun表達明顯增多，說明活化的JNK可進一步激活c-jun參與模型點燃。實驗還需進一步研究其他可能的途徑（如Bcl-2家族成員），進一步闡明杏仁核點燃的分子機制。

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（本文編輯：唐穎馨）

Involvement of p-JNK/p-c-Jun signalingin Amygdala-kindled Seizures

LIXiang1,PANJi-an-qing1,KANGHui-cong2,YANGZhi-gang1,HANJin-ling1,NIELi1,XIAOXiao-hua3,ZHANGLing-ling1, ZHUSui-qiang2

1.Departmentofneurology,NanshanHospital，Shenzhen,Guangdong,518052,China;2.Department ofNeurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430030,China;3.DepartmentofNeurology,SecondPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518052,China

Objective:To evaluate the involement of JNK mitogen-activated protein kinase signaling pathway in amygdala-kindled models.Methods:Twenty Wistar rats were randomly divided into control group(n=10) and kindling group(n=10).Electrodes were implanted into the right amygdala of all the rats.Kindling was accomplished using stimulus strength of 500 μA applied daily to the amygdala until stage 5 were induced in rats for consecutive 10 days.All kindled rats were decapitated 2 h after the tenth stage 5 seizures.Rats in the control group did not receive stimulus.Western blot were performed to test the expression of JNK,p-JNK,c-Jun，p-c-Jun in hippocampus.Results:Kindling increased the expression of p-JNK and p-c-Jun in amygdala-kindled models. The difference is statistical significant between control group and kildling group.Conclusion:p-JNK/p-c-Jun signaling may be involved in amygdala-kindled seizures.

amygdala-kindled;p-JNK;p-c-Jun

R741;R742.1

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.002

1.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科廣東 深圳518052

2.華中科技大學(xué)統(tǒng)計醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030

3.深圳市第二人民醫(yī)院廣東 深圳518052

國家自然科學(xué)基金青年基金（No.81201006）湖北省自然科學(xué)基金（No.2011CDB201）深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計項目分項基金（No.南 科 研 衛(wèi)2012002）深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計項目分項基金（No.南 科 研 衛(wèi)2014015）深圳市科技計劃項目（No.JCYJ20140414 170821276）

2016-01-26

朱遂強zhusuiqiang@163. com