田毅紅，朱志豪，高　媛，張雨婷，李文林，龔大春

(三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

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紅薯發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝優(yōu)化

田毅紅，朱志豪，高媛，張雨婷，李文林，龔大春

(三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

摘要：對(duì)以紅薯為原料、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了紅薯濃度、外加氮源及濃度、乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：當(dāng)紅薯濃度為8%、乙酸銨濃度為2%(即碳氮比為20)、乙酸鈉添加量為0.4%時(shí)，發(fā)酵液中丁醇含量達(dá)到最高，為14.410 mg·mL-1，較優(yōu)化前顯著提高。為發(fā)酵法產(chǎn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：丙酮丁醇梭菌；丁醇；發(fā)酵；紅薯

丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)物的主要成分為丙酮、丁醇和乙醇(簡(jiǎn)稱總?cè)軇珹BE)，比例為3∶6∶1，其中，丁醇占丙酮丁醇梭菌發(fā)酵總產(chǎn)物的60%以上。丁醇是一種重要的有機(jī)溶劑，也是一種極具潛力的新型生物燃料，具有能量密度和燃燒值高、蒸汽壓低、易與汽油混合等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物質(zhì)能源的研究熱點(diǎn)。目前，我國(guó)常用的發(fā)酵產(chǎn)丁醇的淀粉質(zhì)原料為玉米、小麥等，不僅“與人爭(zhēng)食”，而且生產(chǎn)成本偏高，所以開發(fā)廉價(jià)原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。湖北宜昌地區(qū)紅薯資源豐富，價(jià)格便宜，與廣西的木薯類似。因此，作者對(duì)以新鮮紅薯為原料、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為紅薯資源的開發(fā)利用提供有效途徑，也為發(fā)酵法產(chǎn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、菌種與培養(yǎng)基

新鮮紅薯、玉米粉等。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，由艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所提供。

種子培養(yǎng)基: 稱取5g玉米粉加入100mL水配制5%[g干物質(zhì)·(100mL)-1，下同]玉米粉，于沸水浴糊化15min，121 ℃蒸煮滅菌30min。

紅薯培養(yǎng)基：稱取8g新鮮紅薯加入100mL水配制8%紅薯粉，用榨汁機(jī)打漿[1]，沸水浴糊化15min，121 ℃蒸煮滅菌30min。

1.2方法

培養(yǎng)基滅菌后冷卻，按5%的接種量接種后，于100 ℃水浴中熱處理75s，同時(shí)通入無菌氮?dú)?，以排凈培養(yǎng)基及試管中氧氣，再放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72h。采用氣相色譜法及DNS法分別測(cè)定發(fā)酵液中的丁醇及殘?zhí)呛?。通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察紅薯濃度、外加氮源及濃度、乙酸鈉添加量等對(duì)發(fā)酵產(chǎn)丁醇的影響，以確定最優(yōu)發(fā)酵工藝。

1.3分析測(cè)試

(1)新鮮紅薯含水量的測(cè)定：采用恒重法。

(2)新鮮紅薯淀粉含量及發(fā)酵液殘?zhí)呛康臏y(cè)定：準(zhǔn)確稱取一定量的新鮮紅薯或發(fā)酵液，酸解后用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)呛浚聪率接?jì)算紅薯淀粉含量。

紅薯淀粉含量=淀粉含糖量×0.9/(1-含水量)

(3)發(fā)酵液中丁醇含量的測(cè)定：采用氣相色譜法。色譜條件：FID檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，AT-PEG-20M毛細(xì)管色譜柱(50m×0.25mm，0.5μm)，柱溫70 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃，進(jìn)樣量2.0μL，不分流。采用內(nèi)標(biāo)法，異丁醇作為內(nèi)標(biāo)物，采用N2000氣相色譜工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與討論

2.1新鮮紅薯的分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)定，新鮮紅薯含水量為78.16%，淀粉含量為12.33%，折合后紅薯干淀粉含量為57.35%。

2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1紅薯濃度對(duì)發(fā)酵的影響

分別配制紅薯濃度為2%、4%、5%、6%和8%的紅薯培養(yǎng)基，接種后于37 ℃下恒溫靜置培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液中丁醇含量，結(jié)果見圖1。

圖1　紅薯濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖1可看出，發(fā)酵液中丁醇含量隨培養(yǎng)基中紅薯濃度的增大而不斷增加，在紅薯濃度為8%時(shí)達(dá)到10.275 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅薯濃度超過8%時(shí)，糊化后呈半固體狀，發(fā)酵液黏稠，造成傳質(zhì)困難，且發(fā)酵到72 h時(shí)菌體還在旺盛生長(zhǎng)(即發(fā)酵還未到終點(diǎn))，會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期?？紤]到菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵周期等因素，選擇培養(yǎng)基中紅薯濃度為8%。

2.2.2外加氮源對(duì)發(fā)酵的影響

玉米中的蛋白質(zhì)和脂肪含量明顯高于木薯、紅薯等薯類原料。以紅薯為原料可能會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)基中氮源偏低影響丙酮丁醇梭菌的正常生長(zhǎng)[2-3]。因此，在培養(yǎng)基中分別外加初始碳源(紅薯)濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)2%的氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、尿素和乙酸銨等5種氮源進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)呛投〈己?，結(jié)果見圖2。

圖2　外加氮源對(duì)發(fā)酵的影響

由圖2可看出，添加初始碳源濃度2%的乙酸銨為外加氮源時(shí)，發(fā)酵液中丁醇含量最高，達(dá)到13.391 mg·mL-1。因此，外加氮源以乙酸銨為最佳。

2.2.3外加氮源濃度對(duì)發(fā)酵的影響

以乙酸銨為外加氮源，分別在其濃度為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)呛投〈己浚Y(jié)果見圖3。

圖3　外加氮源濃度對(duì)發(fā)酵的影響

由圖3可看出，在外加氮源濃度為2%，即碳氮比為20時(shí)，殘?zhí)呛孔畹?、丁醇含量最高，?3.096 mg·mL-1；在外加氮源濃度為5%時(shí)，菌體幾乎沒有生長(zhǎng)，無丁醇產(chǎn)生，說明過高濃度的乙酸銨對(duì)丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇有抑制作用[4]。因此，外加氮源乙酸銨的濃度以2%為最佳。

2.2.4乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵的影響

乙酸鈉在丙酮丁醇梭菌發(fā)酵中的主要作用是與乙酰輔酶 A 結(jié)合生成乙酰乙酰輔酶 A，作為丙酮和丁醇共同的前體物質(zhì)，該物質(zhì)的增加能提高丁醇的產(chǎn)量，且乙酸鈉還對(duì)丙酮丁醇梭菌細(xì)胞內(nèi)pH值有緩沖作用[5]。因此，可以通過外加乙酸鈉實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝流的調(diào)控。在紅薯培養(yǎng)基中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的乙酸鈉進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中丁醇含量，結(jié)果見圖4。

圖4　乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖4可看出，在乙酸鈉添加量為0.4%時(shí)，發(fā)酵液中丁醇含量達(dá)到最高，為10.406 mg·mL-1。因此，乙酸鈉添加量以0.4%為最佳。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)條件(即紅薯濃度8%、乙酸銨濃度2%、乙酸鈉添加量0.4%)下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中丁醇含量達(dá)到14.410 mg·mL-1，較優(yōu)化前大幅提升。表明優(yōu)化工藝可行，對(duì)紅薯發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

3結(jié)論

對(duì)以紅薯為原料、丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了紅薯濃度、外加氮源及濃度、乙酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：當(dāng)紅薯濃度為8%、乙酸銨濃度為2%(即碳氮比為20)、乙酸鈉添加量為0.4%時(shí)，發(fā)酵液中丁醇含量達(dá)到最高，為14.410 mg·mL-1，較優(yōu)化前顯著提高。為發(fā)酵法產(chǎn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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Optimization on Fermentation Conditions of Butanol from Sweet Potato

TIAN Yi-hong,ZHU Zhi-hao,GAO Yuan,ZHANG Yu-ting,LI Wen-lin,GONG Da-chun

(CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China)

Abstract：Fermentation conditions of Clostridium acetobutylicum to produce butanol by using sweet potato as raw material were optimized.Effects of the concentration of sweet potato,the type and concentration of additional nitrogen source,and the dosage of sodium acetate on fermentation were investigated.The results showed that,when the concentration of sweet potato was 8%,the concentration of ammonium acetate was 2%(C/N value was 20),the dosage of sodium acetate was 0.4%，the content of butanol in fermentation broth reached 14.410 mg·mL-1，which obviously higher than that of non-optimization process.The study lays the foundation for industrialization of butanol production by fermentation.

Keywords：Clostridium acetobutylicum；butanol；fermentation；sweet potato

中圖分類號(hào)：TQ 923

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)02-0064-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.014

作者簡(jiǎn)介：田毅紅(1969-)，女，陜西人，副教授，主要從事生物化工、發(fā)酵方面的研究工作，E-mail：tyh1994@163.com。

收稿日期：2015-11-07