沈　烽,黃　睿，王司辰,曹新益,趙大勇

(1.河海大學 水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098；

2.河海大學水文水資源學院，江蘇 南京 210098)

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不同OTUs劃分閾值對湖泊浮游細菌α多樣性的影響

沈烽1,2,黃睿1,2，王司辰1,2,曹新益1,2,趙大勇1,2

(1.河海大學 水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室，江蘇 南京 210098；

2.河海大學水文水資源學院，江蘇 南京 210098)

摘要：微生物研究中，湖泊浮游細菌微生物群落的α多樣性通過OTUs(operation taxonomy units)來分析評價?？疾炝爽F有手段下不同OTUs劃分閾值或分類單元“屬”水平對α多樣性大小和趨勢的影響，并推斷了分類單元“屬”所對應的OTUs劃分閾值。通過454高通量測序技術研究了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個湖泊的浮游細菌微生物群落，探討了不同OTUs劃分閾值對α多樣性指數OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon的影響。結果發(fā)現，OTUs劃分閾值不同，OTUs和Chao1指數變化一致，Invsimpson和Shannon指數變化一致；在不同的OTUs劃分閾值下，4個湖泊的OTUs和Chao1指數在不同季節(jié)的排序基本保持不變，Invsimpson和Shannon指數在不同季節(jié)的排序發(fā)生改變。表明，分類單元“屬”所對應的OTUs劃分閾值在0.06～0.08范圍內；原有的以0.03或0.1閾值劃分OTUs來分析α多樣性是合理的；所用的分析微生物群落α多樣性方法是全面的、可靠的。

關鍵詞：α多樣性；高通量序列；OTUs；浮游細菌；16S rRNA

對細菌“種”的科學且合理的定義有助于微生物學者準確認識微生物多樣性時空分布特征。細菌本身的特點(如頻繁的基因水平轉移)使得其基因組存在著高度的動態(tài)變化，導致對細菌“種”的定義存在著巨大困難。目前關于微生物多樣性的大部分研究依賴于16SrRNA基因序列的相似性來解釋。通過比較序列與群落中其它未知序列間的相似性,將序列分成不同的操作性分類單元(OTUs)[2-3]。由于微生物類群之間rDNA/rRNA(細菌用16S，真菌主要用ITS)的變異速率不同，僅用16SrRNA基因序列的相似性來定義細菌的分類單元存在很大弊端[3-4]，受研究方法的限制，目前常取閾值0.03或者0.1的16SrRNA基因序列差異性來劃分OTUs[5]。

通過計算基于OTUs表或者種系型(種類和相對豐度)的細菌α多樣性可描述細菌的多樣性。其中，用于表征α多樣性的指數有2大類：

1)計算菌群豐度(communityrichness)的指數

(1)OTUs指數：樣品種OTUs的數量。

(2)Chao1指數：在生態(tài)學中常用來估計物種總數，是用Chao1算法估計群落中含OTUs數目的指數，由Chao于1984年最早提出。按下式計算：

式中：Sobs為實際測量的OTUs數目；n1為只含有1條序列的OTUs數目；n2為只含有2條序列的OTUs數目。

OTUs和Chao1指數反映了微生物群落在數量上的大小程度。

2)計算菌群多樣性(community diversity)的指數

(1)Invsimpson指數： Simpson指數的倒數，由Edward Hugh Simpson 于1949年提出，在生態(tài)學中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。Invsimpson指數值越大，說明群落多樣性越高。按下式計算：

式中：ni為含有i條序列的OTUs數目；N為所有的序列數。

(2)Shannon指數：Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高。按下式計算：

Invsimpson指數和Shannon指數反映了微生物群落在數量結構上的分布特點。

不同的OTUs劃分閾值對α多樣性指數影響較大，閾值0.03或0.1的選取也存在較大的爭議[6-8]。Cleary等[9]探討了不同的OTUs劃分閾值對β多樣性指數的影響。但全面探討OTUs劃分閾值對α多樣性的影響較少。鑒于此，作者通過454高通量測序技術研究了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個湖泊的浮游細菌微生物群落，探討了不同的OTUs劃分閾值對α多樣性指數的影響，以期用更合理的方法來闡明微生物群落的α多樣性。

1實驗

1.1樣品采集

取南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個湖泊0.5 m深水樣，從2011年11月到2012年1月在春夏秋冬4個季節(jié)各采集一次。

1.2DNA提取、PCR擴增和焦磷酸測序

用5 μm過濾器過濾水樣，去除懸浮顆粒物；用0.22 μm乙酸纖維素濾網過濾濾液，收集浮游細菌細胞；按Gillan的方法[10]提取DNA。

將純化后的基因組DNA作為PCR模板，采用通用引物533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)對細菌的16S rRNA進行擴增。PCR引物上固定一個10 bp長度的barcode，用于區(qū)分不同的樣品。PCR反應體系(50 μL)：10 μL 5×Prime STAR buffer(plus Mg2+)，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.4 μmol·L-1上下游引物，2.0 U TaKaRa酶，加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個樣品做3個重復，然后充分混合。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用AxyPrep DNA試劑盒(杭州愛思進生物技術股份有限公司)純化。

PCR擴增結果送至上海美吉公司在羅氏454FLX Titanium平臺上測序。本研究所有的測序結果均被上傳到美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，檢索號為SRP064272。

1.3序列處理

序列處理通過Mothur軟件包完成，流程如下：序列結果通過454標準化操作(SOP)完成。下機原始高通量數據，通過降噪和修剪[11]后，刪除低質量(平均質量<27)、較短(<200 bp)的不包含引物和barcode的序列，并刪除單一堿基連續(xù)出現8次以上的序列[12]。剩余序列被反轉并通過NAST算法與已知 SILVA 16S rRNA 基因數據庫進行對齊[13]。使用Mothur中“chimera.uchime”命令去除嵌合體，“pre.cluster”被用來整理數據加速距離計算過程[14]。得到的序列與RDP 16S rRNA基因數據庫進行比對分類(http://rdp.cme.msu.edu)，相似度達80%以上的結果才允許被使用[15]。采用furthest-neighbor算法[16]用不同的閾值劃分OTUs，在序列差異0.5%～15.0%范圍內每間隔0.5%劃分OTUs。統(tǒng)一數量差異水平并獲得同一比對標準，在計算α多樣性指數前先對每一個樣品使用“subsample”命令進行隨機取樣，保證每個樣品具有相同的測序深度。

1.4統(tǒng)計分析

α多樣性指數(OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon)通過Mothur中“summary.single”命令計算得到。微生物屬熱圖通過R語言中“ggplot2”包計算得到。

2結果與討論

2.1屬水平上微生物α多樣性分析

將得到的序列和RDP 16S rRNA基因數據庫比對，得到了每一條序列所對應的分類學屬(genus)的水平。由于部分序列并不能通過比對得到所對應的屬水平，在分析時并未被考慮。每個樣品中屬水平已分類的序列占總序列的百分比見表1。通過統(tǒng)計每一個屬在每個樣品所占比例繪制的微生物屬熱圖見圖1。

表1屬水平已分類的序列占總序列的百分比/%

Tab.1　Relative percent of classified sequences

注：每個樣品中排名前八的屬被表示出來。顏色深淺表示每個屬在一個樣品中的相對百分比。

由圖1可看出，4個湖泊在屬水平上，藍藻門細菌占主要。高比例的藍藻直接決定了4個湖泊微生物多樣性的高低。春、冬季，低比例的藍藻使得微生物多樣性較高；夏、秋季，高比例的藍藻使得微生物多樣性較低。

屬水平上不同湖泊在不同季節(jié)的微生物α多樣性指數(Invsimpson、Shannon)見表2。

表2屬水平上的微生物α多樣性指數

Tab.2　α-Diversity indexes of microorganisms on

由表2可看出，屬水平上Invsimpson指數與Shannon指數是高度一致的，Spearman相關系數R=0.947(P<0.001)，說明這2個α多樣性指數在屬水平上的評價結果基本一致。可以大致得到屬水平上4個湖泊在不同季節(jié)的微生物α多樣性表現為：莫愁湖：冬>夏≈秋>春；玄武湖：春≈冬>秋≈夏；前湖：冬>春>秋>夏；紫霞湖：冬≈秋>春>夏。

2.2不同OTUs劃分閾值α多樣性分析

在0.5%～15.0%范圍內，每間隔0.5%的步長劃分OTUs，每個樣品得到了30張OTUs表。然后計算每一張表中每一個樣品的α多樣性指數。不同OTUs劃分閾值所對應的α多樣性指數(OTUs、Chao1、Invsimpson、Shannon)見圖2。

圖2　不同OTUs劃分閾值所對應的OTUs指數(a)、Chao1指數(b)、Invsimpson指數(c)、Shannon指數(d)

由圖2a可知，隨劃分閾值的遞進，4個湖泊在不同季節(jié)的OTUs指數逐漸降低，且遞減趨勢保持一致，曲線基本沒有出現交叉的情況，即OTUs指數在不同季節(jié)的差異并未隨劃分閾值的不同而發(fā)生明顯改變，說明，無論選取何種閾值來劃分OTUs，4個湖泊的OTUs指數在不同季節(jié)的排序基本一致，即：莫愁湖：夏>秋≈春>冬；前湖：夏>春>冬>秋；玄武湖：冬>春>夏>秋；紫霞湖：春>夏>秋≈冬。

圖2b與圖2a的結果基本一致，但圖2b中線條之間的交叉明顯多于圖2a，在區(qū)分物種α多樣性時存在明顯的不足。在Chao1指數差異較小時，如莫愁湖的四季、前湖的春秋冬季、玄武湖的春秋冬季，曲線交叉重疊，無法準確判斷。

圖2c、2d與圖2a、2b有明顯差異，線條出現交叉。在Invsimpson指數中，莫愁湖在劃分閾值約為0.06時夏、秋線與冬季線交叉，約0.08時夏、秋線與春季線重合；前湖在劃分閾值為0.06左右時夏季線與冬季線交叉，約0.08時夏季線與春、秋線交叉。也就是說，莫愁湖微生物群落Invsimpson指數在不同季節(jié)的排序表現為：當劃分閾值<0.06時，秋>夏>冬>春；當0.06<劃分閾值<0.08時，冬>夏≈秋>春；當劃分閾值>0.08時，冬>夏≈秋≈春。同樣，前湖數據中也存在這樣的問題?？梢钥闯觯煌膭澐珠撝档玫降臉悠肺⑸锶郝銲nvsimpson指數高低是不同的。而且圖2d與圖2c存在明顯的一致性。

2.3討論

由于很多序列目前還無法準確分類到屬的水平，因此，按照屬水平上的α多樣性指數分析也存在一些缺陷。目前，對序列分析時常常會劃分OTUs，0.03和0.1差異是常用的劃分標準，大致對應科(family)和種(species)的分類學水平。但是由于不同的微生物類群之間rDNA/rRNA的變異速率是不同的，因此這樣的分類也存在一定的缺陷。本研究從不同的角度來探討南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖4個湖泊在不同季節(jié)微生物群落α多樣性的變化，發(fā)現不同角度得出的結論是不同的。

1)OTUs和Chao1指數得出的結果基本一致，而Invsimpson與Shannon指數得出的結果也基本一致，這與它們屬于不同的α多樣性指數類別相關。OTUs和Chao1指數屬于計算菌群豐度的指數，而Invsimpson與Shannon指數屬于計算菌群多樣性的指數。本研究中4個湖泊不同季節(jié)OTUs和Chao1指數隨著OTUs劃分閾值的遞進，曲線不會出現交叉，表明劃分閾值不會影響4個湖泊菌群豐度在不同季節(jié)的排序；而Invsimpson與Shannon指數隨著劃分閾值的遞進，曲線出現交叉，表明劃分閾值會影響菌群α多樣性指數在不同季節(jié)的排序。

2)微生物群落組成差異較大時，可以得出基本一致的結論，如玄武湖：冬≈春>夏≈秋；但是當微生物群落組成差異較小時，得出的結論是不同的。比如，在屬水平上前湖浮游細菌微生物群落α多樣性：冬>春>秋>夏；從Invsimpson指數來看，當劃分閾值<0.06時：夏>冬>春>秋，當0.06<劃分閾值<0.08時：冬>夏>春≈秋，當劃分閾值>0.08時：冬>春>秋>夏。這些結果似乎是互相矛盾的，因此，如果僅僅從一個方面來分析微生物群落的α多樣性都是片面的，不能很好地解釋樣品的微生物群落組成多樣性。

3)由表1可看出，在目前的技術下，依然無法準確判定大量的序列所對應的屬水平，因此相較于樣品之間已知屬水平分類的序列占總序列的百分比相差很大時得出的結論的可靠性較低。本研究中發(fā)現莫愁湖已知屬水平分類的序列占總序列的百分比在不同季節(jié)相差較小，在50%～60%之間，因此可以認為得到的不同季節(jié)在屬水平微生物多樣性是相對可靠的。屬水平上莫愁湖在不同季節(jié)微生物多樣性表現為：冬>夏≈秋>春，對比圖2c、2d發(fā)現，在劃分閾值大約在0.06～0.08時也有冬>夏≈秋>春，由此可以初步推斷屬水平所對應的OTUs劃分閾值可能在0.06～0.08范圍內。

4)一張圖中α多樣性指數曲線交叉點一般都出現在0.04～0.09，這表明OTUs劃分閾值在一定區(qū)域內時對微生物α多樣性影響很大，然而在這個區(qū)域外(<0.04或>0.09)對微生物α多樣性的影響較小。因此，取劃分閾值為0.03(< 0.04)和0.1(> 0.09)來劃分是比較合理的。當α多樣性指數出現交叉時，可以認為在不同的微生物分類學上的α多樣性是不同的。比如，前湖Invsimpson指數在種的水平上：夏>冬>春>秋；然而在科的水平上：冬>春>秋>夏。

3結論

從多個方面探討了南京莫愁湖、前湖、玄武湖、紫霞湖等4個湖泊浮游細菌群落的α多樣性。通過比較OTUs劃分閾值與α多樣性指數曲線，從不同的分類學等級上研究了細菌群落的α多樣性，為更好地理解微生物群落組成和α多樣性奠定了基礎。

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Effects of Different OTUs Cutoff Values onα-Diversity of Bacterioplankton in Lake

SHEN Feng1,2,HUANG Rui1,2,WANG Si-chen1,2,CAO Xin-yi1,2,ZHAO Da-yong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098，China；2.CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,China)

Abstract：The α-diversity of bacterioplankton community in lake is generally evaluated based on OTUs (operation taxonomy units).This study investigated the effects of different OTUs cutoff values or genus level on α-diversity and detected the approximation of OTUs cutoff values which was corresponding to taxonomic level of genera for bacteria.By 454 high-throughput sequencing technology,the bacterioplankton communities of Mochou Lake,Qian Lake,Xuanwu Lake,and Zixia Lake in Nanjing city were studied.Different OTUs cutoff values were assumed to explore the variation of OTUs,Chao1,Invsimpson,Shannon indexes.Results showed that,OTUs and Chao1 indexes showed a consistent change with the variation of OTUs cutoff values,while Invsimpson and Shannon indexes showed a consistent change.Along with the distribution of OTUs cutoff values,OTUs and Chao1 indexes of four lakes remained monotonous compared to each other in different seasons,whereas the results of Invsimpson and Shannon indexes differed with fluctuated values.The taxonomic level of genera was roughly corresponding to differentiation threshold of 0.06～0.08.The well-known thresholds of 0.03 or 0.1 as cutoffs to analyze microbial sequence α-diversity was reasonable.Method for analyzing α-diversity of the microbial community was comprehensive and reliable.

Keywords：α-diversity;high-throughput sequence;OTUs;bacterioplankton;16S rRNA隨著高通量測序技術的日漸流行和廣泛使用，越來越多的稀有菌種被檢測出來，這為微生物群落的深入研究提供了可能。而實際調查研究中，稀有細菌微生物的鑒定往往依賴于主觀分類水平的選取，不同的種屬劃分等級亦導致微生物多樣性計算結果的差異，而微生物多樣性的變化對生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響極大[1]。

中圖分類號：Q 93R 318

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0025-06

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.005

作者簡介：沈烽(1992-)，男，江蘇無錫人，碩士研究生，研究方向：湖泊環(huán)境微生物，E-mail：472779237@qq.com；通訊作者：趙大勇，教授，E-mail：dyzhao@hhu.edu.cn。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(41371098，41571108)，江蘇省自然科學基金資助項目(BK20151614)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(2015B14214，2015B31714)

收稿日期：2015-11-13