南文濱 徐志浩 王永學(xué) 陳紅麗

453003新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；河南省高校干細(xì)胞與生物技術(shù)治療工程中心

脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性研究

南文濱 徐志浩 王永學(xué) 陳紅麗

453003新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；河南省高校干細(xì)胞與生物技術(shù)治療工程中心

目的對(duì)脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）間的生物相容性進(jìn)行研究。方法將BMSCs與脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs為對(duì)照組，對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)和增殖情況進(jìn)行研究，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料上的貼附生長(zhǎng)情況，并采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性。結(jié)果掃描電鏡結(jié)果顯示BMSCs在脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料上生長(zhǎng)良好。CCK-8法測(cè)得的BMSCs與脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料具有較好的生物相容性，這為脫細(xì)胞膠原基質(zhì)組織工程支架雙層材料下階段在體內(nèi)動(dòng)物中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物相容性；脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料

Fund program：Natural Science Foundation of China(U1304819);Scientific Research Fund of Xinxiang Medical University(2014QN137)

0 引言

創(chuàng)面的愈合是一個(gè)由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子多因素共同參與并高度協(xié)調(diào)、相互調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程[1]。對(duì)于大面積皮膚創(chuàng)傷和慢性皮膚創(chuàng)傷，皮膚組織的自我修復(fù)能力有限，需要人為干預(yù)促進(jìn)創(chuàng)口愈合。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作為干細(xì)胞的一種，具有自我更新及全向分化為特定細(xì)胞群的能力，其用于修復(fù)皮膚創(chuàng)傷顯示出良好的效果，因此常被作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞。

在皮膚組織工程中，所制備的生物材料需具備相應(yīng)的物理化學(xué)性能，并具有較好的生物相容性來確?？蓱?yīng)用于臨床。皮膚組織脫細(xì)胞材料具有良好的生物相容性，但其機(jī)械強(qiáng)度不高；而膠原材料具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，但持有營(yíng)養(yǎng)成分能力不強(qiáng)，難以支持細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)。筆者將這兩種材料交聯(lián)形成雙層脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料，評(píng)價(jià)其與BMSCs的相容性，以期這兩種材料可發(fā)揮各自優(yōu)點(diǎn)，為組織工程皮膚應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供參考。

組織工程研究中對(duì)制備材料的生物相容性的檢測(cè)分為動(dòng)物體內(nèi)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)是將材料植入模型動(dòng)物中檢測(cè)材料的生物相容性，而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)是直接觀察材料對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、周期及增殖等方面的影響，較動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更直觀，本研究采用的便是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

本研究從雌性小鼠體內(nèi)篩選出BMSCs，然后運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMSCs表面干性標(biāo)記，再用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并用掃描電鏡觀察BMSCs在雙層脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料上的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而評(píng)價(jià)雙層脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料與BMSCs的生物相容性，為進(jìn)一步開展組織工程化人工器官的研究及臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

6周齡健康昆明種小鼠（清潔級(jí)，體質(zhì)量20～22g）（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、D-Hank's、胰酶、胎牛血清、雙抗（美國(guó)Life公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CD29-PE抗體、CD44-FITC抗體（美國(guó)BD公司），膠原溶脹液（以豬皮為原料，采用胃蛋白酶消化法自制，主要成分為I型膠原，含量＞95%）。

恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司）、FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），BX-4096掃描電鏡（日本電子株式會(huì)社），SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料的制備

將豬源真皮皮片放入含30 ml 0.05%胰蛋白酶的離心管中，4℃過夜后用PBS沖洗；加入新的胰蛋白酶液37℃水浴1 h；然后放入冰箱4℃20 min，再放入超低溫冰箱-70℃1 h，再37℃水浴5 min，如此循環(huán)3次；最后用PBS沖洗，將其置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，與膠原溶脹液按體積比1∶1復(fù)合后，用體積分?jǐn)?shù)為0.3%的戊二醛溶液交聯(lián)。采用放射方式進(jìn)行消毒處理，封裝備用。

1.2.2 小鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)

用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉小鼠，切取小鼠四肢的股骨和脛骨；以DMEM/F12培養(yǎng)基穿刺沖洗股骨和脛骨的骨髓腔，并對(duì)沖洗液進(jìn)行過濾處理，12 000 r/min離心3～5 min，再用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。每天換液，約10 d后細(xì)胞生長(zhǎng)至80%，使用胰酶消化并傳代培養(yǎng)。約每3天傳代1次，傳至第4代時(shí)可見雜細(xì)胞較少，選取狀態(tài)良好的第4代之后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 BMSCs的表面干細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)

將小鼠BMSCs消化后，用D-Hank's溶液重懸于流式細(xì)胞管中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD44等干細(xì)胞表面標(biāo)記。

1.2.4 脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料的預(yù)處理

取不同大小的脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料分別置于24孔或96孔培養(yǎng)板中，使用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育培養(yǎng)板約48 h。

1.2.5 脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料與BMSCs共培養(yǎng)的掃描電鏡觀察

將脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料置入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，按上述方法孵育后，加入BMSCs懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)4～5 d后取出材料，用甲醛固定，臨界點(diǎn)干燥，鍍金膜，最后在掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料上的附著情況。

1.2.6 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取合適大小的脫細(xì)胞膠原雙層基質(zhì)材料置于96孔培養(yǎng)板中按1.2.4所述方法預(yù)處理。取7塊96孔培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板分為2組，加入脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料的作為實(shí)驗(yàn)組，未加入材料的為對(duì)照組，每組8孔。將小鼠BMSCs接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液。于細(xì)胞接種后的7 d內(nèi)，每天取1塊板進(jìn)行檢測(cè)，向每孔中加入CCK-8試劑10 μl，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度值，取平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)

原代培養(yǎng)的小鼠BMSCs在48 h內(nèi)大部分貼壁，細(xì)胞呈短梭形、多邊形，2周左右細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài)（圖1）；傳代培養(yǎng)的BMSCs可在12 h內(nèi)基本貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形態(tài)。

圖1 相差顯微鏡下原代小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)（×100）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原

研究表明，CD29和CD44是BMSCs的表面干性標(biāo)記。傳代至大約第5代時(shí)，大部分細(xì)胞為BMSCs。使用流式細(xì)胞儀對(duì)分離出的小鼠BMSCs進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)CD29及CD44的著色程度設(shè)定流式門，結(jié)果顯示CD29+CD44+雙陽性率為70.66%，證明分離出的細(xì)胞大部分為BMSCs。（圖2）

圖2 CD29和CD44表面干性標(biāo)記的流式檢測(cè)結(jié)果

2.3 脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料與BMSCs共培養(yǎng)的掃描電鏡觀察

將脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料與BMSCs共培養(yǎng)至第5天時(shí)，可見脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料的表面有細(xì)胞附著，細(xì)胞形態(tài)正常，伸出偽足黏附在材料上，表明脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料對(duì)細(xì)胞的貼附無影響。（圖3）

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)

采用CCK-8法檢測(cè)脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料對(duì)BMSCs增殖的影響。以細(xì)胞活度（吸光度值）繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在一周內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性均呈增加的趨勢(shì)，且兩組生長(zhǎng)曲線間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討論與結(jié)論

圖3 脫細(xì)胞膠原基質(zhì)材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)第5天的掃描電鏡圖（×100）

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1周內(nèi)的生長(zhǎng)曲線

當(dāng)人因外傷、疾病等原因?qū)е缕つw缺損時(shí)，具有多能性的皮膚干細(xì)胞可增殖分化為多種細(xì)胞，完成對(duì)皮膚的修護(hù)，因此，皮膚干細(xì)胞引起了科學(xué)家們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。BMSCs具有能進(jìn)行自我復(fù)制、快速增殖、多能性等特點(diǎn)，在特定條件下可形成骨、軟骨、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞[2-8]。CD29和CD44是BMSCs的表面干性標(biāo)記[9-10]。使用流式細(xì)胞儀對(duì)分離出的BMSCs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CD29陽性率為80.9%，CD44陽性率為72.91%，證明分離出的細(xì)胞大部分為BMSCs。本研究使用CCK-8法檢測(cè)脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料對(duì)BMSCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在一周內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性均呈增加的趨勢(shì)，且兩組生長(zhǎng)曲線間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)無毒性。

皮膚組織脫細(xì)胞材料具有良好的組織相容性[11-18]，而膠原材料具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度，將兩者交聯(lián)形成雙層材料以更好地發(fā)揮各自優(yōu)點(diǎn)，該雙層材料與干細(xì)胞復(fù)合在皮膚損傷方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，該復(fù)合材料要應(yīng)用于臨床還需檢測(cè)其生物相容性。本研究在掃描電鏡下觀察到BMSCs可在脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料的表面正常生長(zhǎng)，且狀態(tài)良好。CCK-8法的檢測(cè)結(jié)果顯示BMSCs的增殖功能良好，表明脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料對(duì)小鼠BMSCs的生長(zhǎng)無毒性。綜上所述，脫細(xì)胞膠原基質(zhì)雙層材料與BMSCs具有較好的生物相容性，該研究結(jié)果為此復(fù)合材料的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Biocompatibility of bone marrow mesenchymal stem cells on acellular collagen matrix double-layer material

Nan Wenbin,Xu Zhihao,Wang Yongxue,Chen Hongli
School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University;Stem Cell and Biotherapy Technology Research Center of Henan Province,Xinxiang 453003,China
Corresponding author:Chen Hongli,Email:chenhlhl@126.com

ObjectiveTo study the biocompatibility of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on acellular collagen matrix double-layer material.MethodsBMSCs with acellular collagen matrix double-layer material were trained as experimental group,while separately cultured BMSCs as control group.The growth and proliferation of BMSCs on acellular collagen matrix double-layer material were investigated.Scanning electron microscope was used to observe the adherence of cells,and cell vitality was detected by CCK-8 method.ResultsThe acellular collagen matrix double-layer material did not influence the growth and proliferation of BMSCs.The difference between the growth curves of experimental group and control group was not significant(P＞0.05).ConclusionsThe acellular collagen matrix double-layer material has acceptable biocompatibility.This research provides a scientific basis for the application of this composite material.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Biocompatibility;Acellular collagen matrix doublelayer material

陳紅麗，Email:chenhlhl@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.01.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（U1304819）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金（2014QN137）

2015-10-15）