梁崟

300011天津市職業(yè)病防治院（天津市工人醫(yī)院）放射科

放療在大腸癌中作用分子靶標(biāo)的篩選

梁崟

300011天津市職業(yè)病防治院（天津市工人醫(yī)院）放射科

目的基于基因表達(dá)譜芯片，利用生物信息學(xué)方法，探索放療在大腸癌治療中的重要靶點(diǎn)。方法在GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE15781基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用R編程語言得到放療后大腸癌樣本相對于未放療大腸癌樣本、未放療大腸癌樣本相對于未放療正常大腸樣本的差異表達(dá)基因。利用DAVID在線工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，對于在兩組差異表達(dá)基因中同時(shí)出現(xiàn)的部分，利用HPRD數(shù)據(jù)庫構(gòu)建它們的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果放療后的大腸癌樣本相對于未放療的大腸癌樣本存在702個(gè)差異表達(dá)基因；與未放療的正常大腸組織相比，未放療的大腸癌樣本中存在126個(gè)差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖等與細(xì)胞生物活動(dòng)及炎癥相關(guān)的生物過程中；且這兩組差異表達(dá)基因重合了16個(gè)基因，在它們的PPI網(wǎng)絡(luò)中，PTGS2、SDCBP2等基因與其他基因聯(lián)系較密切，可能是放療的重要靶標(biāo)基因。結(jié)論通過基因表達(dá)譜的分析，可能得到大腸癌放療的重要靶標(biāo)，這對其實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療具有非常重要的意義。

表達(dá)譜；生物信息學(xué)；大腸癌；放療

0 引言

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，主要包括結(jié)腸癌和直腸癌[1]。隨著我國居民經(jīng)濟(jì)條件和人口結(jié)構(gòu)等的變化，大腸癌的發(fā)病率和死亡率在逐年上升，且被確診時(shí)大都屬于中晚期[2]。以手術(shù)治療為主，輔之以放療，是當(dāng)前主流的大腸癌治療方式，且對于早期大腸癌，單純的放療即可根治[3]。因此，放療越來越受到國內(nèi)專家的重視。然而，大腸癌或其他癌癥對放療的敏感性受多種因素的影響，如低氧[4]、某些基因表達(dá)水平的變化[5]等。因此，探索影響大腸癌對放療敏感性的生物標(biāo)記，尋找放療作用的分子靶標(biāo)，將有助于提高放療效率，改善患者預(yù)后。目前，已發(fā)現(xiàn)部分基因和通路能影響癌癥對放療的敏感性，如靶向Notch信號通路能克服癌癥對放療的抵抗[6]；Liao等[7]通過基因敲除結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在大腸癌中microRNA-32能通過靶向DAB2IP基因誘導(dǎo)癌細(xì)胞對放療產(chǎn)生抗性。這些研究均為癌細(xì)胞對放療抵抗機(jī)理的了解提供了重要靶標(biāo)和線索，但要達(dá)到改善癌癥放療預(yù)后的目的，還需大量的研究來探索放療敏感性靶標(biāo)。本研究通過分析美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/）GEO數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，在比較大腸癌樣本相對于正常樣本的基因表達(dá)差異基礎(chǔ)上，進(jìn)行放療前后大腸癌中基因表達(dá)譜的比較，能更有針對性地研究與癌癥相關(guān)的基因?qū)Ψ暖煹拿舾行?，并得到潛在的敏感基因，以有助于改善放療后大腸癌的預(yù)后。

1 方法

1.1 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的獲取

首先從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)于大腸癌放療研究的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，編號是GSE15781，由來自特羅姆瑟大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)及分子醫(yī)學(xué)研究所的Paulssen等提供[8]。該數(shù)據(jù)采用GPL2986平臺(tái)（ABI Human Genome Survey Microarray Version 2），包括13個(gè)未經(jīng)放療的大腸癌樣本和9個(gè)經(jīng)過放療的大腸癌樣本，除此之外，還包括10個(gè)未經(jīng)放療的正常大腸癌組織和10個(gè)經(jīng)過放療的正常大腸組織。

1.2 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理

芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理采用R語言的preprocessCore函數(shù)包進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，并把檢測的信號值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，作為基因表達(dá)值。

1.3 差異表達(dá)基因分析

基因差異表達(dá)分析基于R語言的limma函數(shù)包進(jìn)行。對基因在不同樣本間的表達(dá)值進(jìn)行t檢驗(yàn)和Benjamini-Hochberg（BH）校正，同時(shí)滿足變化倍數(shù)（Fold change）＞2或＜0.5且校正P＜0.01的基因被選為差異表達(dá)基因。

1.4 基因功能富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具，對得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。以DAVID中默認(rèn)的基因集為背景基因，至少包含了5個(gè)基因且P＜0.05的基因本體（Gene Ontology，GO）terms和KEGG通路被認(rèn)為是差異表達(dá)基因富集的功能。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對于在放療后的大腸癌樣本相對于未放療的大腸癌樣本以及未放療的大腸癌樣本相對于未放療的正常大腸樣本同時(shí)發(fā)生差異表達(dá)的基因，利用HPRD（http://www.hprd.org/）數(shù)據(jù)庫篩選它們之間的相互作用，再利用Cytoscape軟件對這些相互作用進(jìn)行可視化，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)化后芯片數(shù)據(jù)

在差異表達(dá)分析之前，先對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理結(jié)果見圖1。由圖可看出，標(biāo)準(zhǔn)化之后各樣本之間所有基因的表達(dá)值范圍基本一致，這說明芯片的標(biāo)準(zhǔn)化消除了系統(tǒng)偏差。

圖1 預(yù)處理后每個(gè)樣本中所有基因的表達(dá)值

2.2 差異表達(dá)基因

利用limma函數(shù)包對GSE15781數(shù)據(jù)集中的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，分別得到了放療后的大腸癌樣本相對于未放療的大腸癌樣本、放療后的正常大腸組織相對于未放療的正常大腸組織以及未放療的大腸癌樣本相對于未放療的正常大腸樣本的差異表達(dá)基因，3組差異表達(dá)基因中包含的上、下調(diào)基因個(gè)數(shù)見表1。

表1 從GSE15781中得到的3組差異表達(dá)基因中包含的上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)

2.3 差異表達(dá)基因功能富集分析

利用DAVID在線工具，對放療后大腸癌相對于未放療大腸癌樣本的702個(gè)差異表達(dá)基因和未放療大腸癌相對于未放療正常大腸組織的126個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞黏附等生物過程相關(guān)，除此之外，與炎癥和癌癥發(fā)展等相關(guān)的功能和通路在這些基因中也是富集的。這兩組差異表達(dá)基因富集的主要生物過程和通路見圖2。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

在放療后大腸癌樣本相對于未放療大腸癌樣本的差異表達(dá)基因與未放療大腸癌樣本相對于未放療正常大腸組織的差異表達(dá)基因之間，得到了16個(gè)重合基因，這16個(gè)重合基因在這4組樣本中的表達(dá)值熱圖見圖3。同時(shí)利用HPRD數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了這些基因的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖2 兩組差異表達(dá)基因涉及的主要生物過程和通路

圖3 重合的差異表達(dá)基因在4組樣本中的表達(dá)值熱圖

圖4 重合差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論與結(jié)論

基因的差異表達(dá)在許多疾病的治療中起著非常重要的作用[9-10]。在大腸癌中，某些基因的表達(dá)變化能影響細(xì)胞的增殖或凋亡，介導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)來影響患者對放療的敏感性[11-12]。同時(shí)，放療又可通過改變基因的表達(dá)，來起到治療癌癥的作用，故篩選出癌癥放療的作用靶標(biāo)顯得尤為重要。

本研究中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，放療后的大腸癌相對于未放療的大腸癌樣本存在702個(gè)差異表達(dá)基因，而放療后的正常大腸組織相對于未放療的正常大腸組織卻只有5個(gè)差異表達(dá)基因，這說明放療對正常組織的影響非常小，卻能改變大腸癌樣本中許多基因的表達(dá)。這些差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和免疫、炎癥反應(yīng)等與癌癥密切相關(guān)的生物過程。而在大腸癌中，細(xì)胞的凋亡更能直接影響患者對放療的抵抗反應(yīng)[13]，且對放療敏感性高的大腸癌患者相對于敏感性低的大腸癌患者，有較高的瘤內(nèi)免疫活性[14]，這進(jìn)一步說明了免疫反應(yīng)在放療中的作用。

在實(shí)現(xiàn)某一生物過程或產(chǎn)生某種表型時(shí)，基因通常以整體的形式發(fā)揮作用，而不是單個(gè)基因。因此，在本研究中，對于在未放療大腸癌相對于未放療正常大腸樣本和放療后大腸癌相對于未放療大腸癌同時(shí)發(fā)生差異表達(dá)的16個(gè)基因，筆者基于HPRD數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了它們的PPI網(wǎng)絡(luò)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，PITX2與15個(gè)基因發(fā)生了相互作用，且由圖3可知，PITX2在由正常大腸組織向大腸癌轉(zhuǎn)變的過程中表達(dá)值升高，而在放療后表達(dá)值降低，這說明PITX2可能是重要的大腸癌致癌基因。PITX2的染色體位置為4q25（4號染色體長臂，2區(qū)5帶），由它編碼的蛋白質(zhì)作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)膠原賴氨酰羥化酶基因的表達(dá)，該蛋白在生長激素細(xì)胞的終端分化中有非常重要的作用。在Hirose等[15]的研究中，PITX2也被證實(shí)在大腸癌中明顯高表達(dá)，并與大腸癌的預(yù)后顯著相關(guān)；此外，PITX2還被認(rèn)為是食管鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌的重要放療靶點(diǎn)[16-17]，因此PITX2也可能是大腸癌中放療的重要分子靶標(biāo)。類似的，ETV4基因在由正常大腸組織向大腸癌轉(zhuǎn)變時(shí)表達(dá)值升高，而在放療后表達(dá)值降低。ETV4的染色體位置為17q21.31，又名E1AF、PEA3、E1AF、PEAS3，其突變與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，包括大腸癌[18]。作為一種蛋白質(zhì)編碼基因，ETV4的差異表達(dá)能促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，被許多研究認(rèn)為是大腸癌發(fā)病的重要分子靶標(biāo)[19]，但卻未在放療中被研究過，ETV4可能是大腸癌中一個(gè)新的放療分子靶標(biāo)。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，篩選得到了大腸癌放療后潛在的作用靶標(biāo)，并探索了可能發(fā)生變化的生物過程，這將為大腸癌的治療和研究提供一定的方向。然而，要確定這些分子靶標(biāo)是否可靠，還需進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

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Identification of molecular targets of radiotherapy in colorectal cancer

Liang Yin
Department of Radiology,Occupational Disease Prevention Hospital in Tianjin(Tianjin Hospital Workers),Tianjin 300011,China

ObjectiveTo explore the potential therapeutic targets of radiotherapy in colorectal cancer via bioinformatics analysis of gene expression microarray.MethodsThe gene expression dataset GSE15781 was downloaded from the GEO database.The differentially expressed genes in radiotherapy treated colorectal cancer samples compared with those without radiotherapy,as well as differentially expressed genes in colorectal cancer samples without radiotherapy compared with normal colorectal tissues without radiotherapy,were obtained by R programming.The DAVID database was used for the functional enrichment analysis of the differentially expressed genes.Besides,protein-protein interaction(PPI)network of the overlapped genes between the two groups of differentially expressed genes were constructed based on the HPRD database.ResultsA total of 702 differentially expressed genes were obtained for the radiotherapy treated colorectal cancer samples compared with the ones without radiotherapy.Besides,126 differentially expressed genes in colorectal cancer samples without radiotherapy compared with normal colorectal tissues without radiotherapy were identified.Biological processes that related to cell adhesion,cell proliferation,as well as inflammatory response were found to be enriched in those differentially expressed genes.Moreover,16 overlaps were found between the two groups of differentially expressed genes,and in the PPI network of the 16 overlapped genes,PTGS2 and SDCBP2,etc,were closely correlated with other genes,which might be the important therapeutic targets of radiotherapy.ConclusionsSome potential therapeutic targets of radiotherapy in colorectal cancer can be obtained by analysis of gene expression profiles,which may be very important for the study and treatment.

Gene expression profile;Bioinformatics;Colorectal cancer;Radiotherapy

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．01．007

2015-11-07）