李 輝 蘇 偉 許東琳 傅永鴻 陳偉明 周 慧 楊自力

(廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510180)

·論著·

內皮祖細胞移植對急性肺損傷大鼠的抗炎效應

李 輝 蘇 偉 許東琳 傅永鴻 陳偉明 周 慧 楊自力*

(廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東 廣州 510180)

目的:研究內皮祖細胞(EPC)移植對急性肺損傷(ALI)大鼠的抗炎效應。方法：將60只雄性SD大鼠隨機分為對照組、ALI組、EPC組，每組各20只。ALI組和EPC組采用LPS(5 mg/kg)靜脈注射制備ALI模型，EPC組在造模成功半小時后予EPC懸液移植，觀察3組干預過程中血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平的變化，以及肺濕/干重比值(W/D)、TLR9表達和NF-κB活性的變化。 結果：造模后ALI組和EPC組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平均顯著升高(P<0.05)。造模7 d后，EPC組大鼠TLR9表達和NF-κB活性顯著低于ALI組(P<0.05)，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平也低于ALI組(P<0.05)。 結論：EPC移植可以減輕ALI大鼠的炎癥反應，具有一定的抗炎效應。

內皮祖細胞移植；急性肺損傷；大鼠；細胞因子

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床常見的危重癥，死亡率高達40%，其發(fā)病機制尚未完全清楚[1]。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，在外周循環(huán)中對血管內皮的形成、分化及修復起到重要作用[2-3]。研究表明，EPCs參與人胚胎血管形成，同時參與出生后血管新生和內皮損傷的修復過程[4]，還具有免疫調節(jié)作用，能參與炎癥反應的組織修復[5-7]。本研究通過觀察ALI大鼠在EPCs移植干預后血清炎癥介質及肺組織TLR9表達和NF-κB活性的變化，探討EPCs移植對ALI發(fā)病過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質量250～300 g，隨機分為對照組、ALI組、EPC組，每組各20只。另外選取清潔級健康SD大鼠60只，6周齡，體質量100～150 g，用于EPC的采集。所有實驗動物由廣州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 制備模型和獲取標本

1.2.1 制備模型 將大鼠固定于動物實驗臺，經(jīng)尾靜脈注射脂多糖(LPS)5 mg/kg，即得內毒素致ALI動物模型。對照組僅注射等量的生理鹽水。

1.2.2 獲取標本 造模第7天活殺所有大鼠，即刻開胸取出雙肺，取右肺10%組織送病理學檢查，其余組織用于測量濕/干重比值(W/D)，左肺組織用于TLR9表達和NF-κβ活性檢測。經(jīng)鼠尾靜脈取外周血，常溫下靜置2 h，5℃以3 000 r/min離心8 min，取上清液，以-80℃冰箱保存集中檢測細胞因子。

1.3 EPCs的制備和移植

1.3.1 EPCs的體外培養(yǎng)及鑒定 取大鼠四肢長骨骨髓，F(xiàn)icoll密度梯度離心法獲取單個核細胞，接種于EGM2培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)與10%胎牛血清中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，前4天隔天換1/2液，第4天PBS洗去未貼壁的細胞，第7天換全液。制備細胞進行免疫雙熒光法鑒定，雙染色陽性的細胞即為正在分化的內皮祖細胞，光鏡下可見梭形細胞，成簇狀分布。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可看到雙染色陽性的正在分化的內皮祖細胞。胰酶消化后用無菌PBS稀釋成細胞懸液備用(細胞濃度1×109/L)。

1.3.2 EPCs移植 造模半小時后，取1 mL制備好的EPCs細胞懸液經(jīng)尾靜脈注入EPC組大鼠，而ALI組大鼠同法僅給予等量的PBS。

1.4 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的檢測

采用商品化的ELISA試劑盒(美津生物公司)，按照說明書方法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的濃度。

1.5 肺組織濕重/干重(W/D)比值

取右肺上葉組織，用濾紙吸走表面附著的水分與血漬，稱得濕重(wet weight，W)后將其置于60 ℃ 恒溫箱中72 h至重量不再改變，取出稱得干重(dry weight，D)，計算W/D比值。

1.6 TLR9表達的測定

取肺組織，使用Trizol法分離溶解組織并提取RNA，再取等量總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。再用RT-PCR 進行擴增，RT-PCR條件為94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72℃延伸90 s，共33個循環(huán)。采用熒光定量PCR儀檢測TLR9在肺組織中的表達。

1.7 檢測NF-κB活性

取肺組織，在冷PBS中勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，棄上清，洗2次。細胞沉淀用0.8 mL冷低滲鹽溶液懸浮，加100 μL 10%NP-40裂解細胞，置冰浴上腫脹15 min，強烈震蕩45 s，11 000 r/min，低溫離心20 min。棄上清，用100 μL細胞核蛋白提取緩沖液重懸沉淀，4 ℃震蕩30 min，21 000 r/min，低溫離心10 min，收集上清即為核蛋白提取物，-80 ℃保存待測。采用Mercury轉錄因子ELISA法測定試劑盒集中測定肺組織NF-κB活性。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 EPCs移植對血清炎癥介質水平的影響

造模7 d后，ALI組和EPC組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平均較造模前明顯上升(P<0.05)，EPC組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05)，提示EPCs移植能顯著降低ALI大鼠循環(huán)中促炎癥介質水平，具有一定的抗炎效應。見表1。

表1 EPCs移植前后血清炎癥介質的變化

注：與ALI組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.2 EPCs移植對肺組織炎癥反應的影響

造模7 d后，ALI組W/D較對照組降低(P<0.05)；ALI組和EPC組肺組織TLR9表達和NF-κB活性均較對照組顯著升高(P<0.05)，但EPC組肺組織TLR9表達和NF-κB活性顯著低于ALI組(P<0.05)。見表2。

表2 EPCs移植前后W/D及TLR9表達、NF-κB活性的變化

注：與ALI組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

3 討 論

ALI/ARDS的病因及發(fā)病機制錯綜復雜，致病環(huán)節(jié)眾多，病死率高，已成為重癥醫(yī)學研究的熱點和難點。ALI被認為是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的早期階段，其發(fā)病過程由多種炎癥介質及效應細胞共同參與，并呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)反應和繼發(fā)性彌漫性肺實質損傷，其特征是廣泛的肺微血管內皮細胞的壞死、凋亡及功能失調[8]。本研究結果顯示，造模后ALI組和EPC組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎癥介質水平都隨時間推移有不同程度升高，提示炎癥反應參與了ALI的發(fā)病過程。

Asahara等[10]描述了一群人類循環(huán)CD34+細胞，在體外經(jīng)過分化后具有內皮細胞特征，這些細胞被稱為“內皮祖細胞”。創(chuàng)傷后機體內缺血、缺氧以及血管內皮損傷是介導EPCs動員、歸巢和分化的最顯著信號。既然血管內皮細胞損傷是ALI發(fā)病過程的特征之一，理論上EPCs移植應對ALI的組織損傷具有一定的修復作用。本研究結果顯示，造模7 d后EPC組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平等促炎癥介質較ALI組明顯下降(P<0.05)，說明機體的炎癥反應得到一定程度的改善，提示EPCs移植可在一定程度上阻止ALI的發(fā)病過程，并具有一定的抗炎效應。

NF-κB通路是TLR9依賴的MyD88-IRAK4-TRAF6信號轉導的下游分支信號，其變化和炎癥反應的發(fā)生和轉歸密切相關。本研究結果還顯示，造模后ALI組和EPC組TLR9表達和NF-κB活性均較對照組增加，但EPC組TLR9表達和NF-κB活性則較ALI組下降，提示TLR9-NF-κB信號轉導系統(tǒng)可能參加了ALI發(fā)病的炎性反應過程，內皮祖細胞可能通過下調TLR9-NF-κB信號系統(tǒng)從而弱化了ALI發(fā)病的炎性反應過程，具有一定的抗炎效應和肺保護作用。

綜上所述，炎癥反應在ALI發(fā)病過程中起著重要作用，TLR9信號通路可通過調節(jié)其下游的NF-κB等信號通路參與了炎癥反應的調控，而EPCs移植則在ALI發(fā)病過程中一定程度上弱化了肺組織的炎癥反應，推測具有一定的抗炎效應和肺保護作用，為治療ALI提供了新的思路，因此，有待進一步研究明確EPCs移植干預ALI發(fā)病過程的具體機制，為臨床上防治ALI提供可靠的理論基礎。

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(本文編輯:張輝)

Anti-inflammatory effect of endothelial progenitor cells transplantation in rats with acute lung injury

LiHui,SuWei,XuDonglin,FuYonghong,ChenWeiming,ZhouHui,YangZili*

(DepartmentofCriticalCareMedicine,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

*Correspondingauthor:Email:yangzilil8888@163.com

Objective:To investigate the anti-inflammatory effect of endothelial progenitor cells (EPCs) transplantation in rats with acute lung injury. Methods: Sixty male SD rats were randomly divided into the control group,ALI group and EPC group (n=20 each).The ALI group and EPC group were treated with LPS (5 mg/kg) intravenously to prepare ALI model. The EPC group was given cell suspension transplantation at half an hour after successful modeling. The changes of serum TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 levels,wet-to-dry lung weight (W/D)ratio,TLR9 expression and NF-κB activity during the intervention were determined in the three groups. Results: The serum TNF-α,IL-1β,IL-6,and IL-10 levels in the ALI group and EPC group were significantly increased (P<0.05). At 7 d after modeling,the expression of TLR9 and the activity of NF-κB in the EPC group were significantly lower than those in the ALI group (P<0.05),and the serumTNF-α,IL-1β and IL-6 levels inthe EPC group were also lower than those in the ALI group (P<0.05). Conclusion: EPCs transplantation can relieve inflammatory reaction in rats with acute lung injury with anti-inflammatory effect.

endothelial progenitor cells transplantation; acute lung injury; rats; cytokine

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.05.03

廣州市科技攻關項目(201300000196)

*通訊作者：Email:yangzilil8888@163.com

R563，Q813.3

A

2095-9664(2016)05-0015-03

2016-08-15)